真空包装酱卤豆干制品腐败菌检测及灭菌工艺优化

翟平平，朱应飞，范宏伟，杨 艳，刘 德，章志超，淦 露，吴 鑫

(江西省食品检验检测研究院，江西 南昌 330000)

真空包装酱卤豆干制品腐败菌检测及灭菌工艺优化

翟平平，朱应飞，范宏伟，杨 艳，刘 德，章志超，淦 露，吴 鑫*

(江西省食品检验检测研究院，江西 南昌 330000)

用国标方法，对保质期内胀袋的酱卤豆干制品的菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌进行检测，并对分离出的单菌落进行纯化培养和鉴定。另取样品高压灭菌后两两分组，添加等量的上述分离菌种，然后再分别按照100 ℃ 10 min、100 ℃ 15 min、110 ℃ 10 min、110 ℃ 15 min、121 ℃ 10 min、121 ℃ 15 min、121 ℃ 30 min的灭菌条件进行灭菌，灭菌后，每组样品中的一份放入36 ℃培养，另一份放入4 ℃冰箱冷藏，10 d后，观察灭菌效果。结果显示，保质期内胀袋样品中的菌落总数在7.2×105～6.5×108g-1，但大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌均未检出。除100 ℃ 10 min、100 ℃ 15 min、110 ℃ 10 min、灭菌处理的样品有大量微生物增殖，110 ℃ 15 min组有少许微生物增殖现象外，其余灭菌组均未出现异常现象。从产品口感和经济角度考虑，最终确定121 ℃ 10 min为最佳灭菌条件。

酱卤豆干制品； 微生物； 灭菌工艺

酱卤豆干制品是以豆腐为原料，添加调味料卤制而成的一种传统豆制品，由于豆腐中含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物及钙、磷、铁，以及维生素B族等人体必需的营养物质和丰富的生物活性物质，是一种集营养与保健功能于一体的健康食品[1]。为了方便携带和储存，市面上的酱卤干制品大都以真空包装方式出售；然而，由于豆制品含有丰富的营养成分，在运输和储存方面易受到微生物污染而出现胀袋、泄露、腐败变质等问题，是现期制约我国豆制品发展的重要因素。据统计，非发酵性豆制品微生物指标检测，菌落总数合格率仅为38.33%[2]。菌落总数超标会引起食品腐败变质，被人食用后易导致食源性疾病的发生，严重影响产品品质与安全，危及消费者健康[3]。因此，对真空酱卤豆干制品杀菌环节的控制问题务必重视。

国内酱卤豆干制品目前还是以传统工艺生产为主，加工过程中，不额外添加任何人工防腐剂，虽采用真空包装及高压蒸汽灭菌，但在此过程中的菌相复杂，使得真空包装的酱卤豆干制品很容易因灭菌不彻底或者包装密封性不够而产生“胀袋”现象，增加了酱卤豆干制品真空包装产品的不合格率。因此，如何在保证酱卤豆干制品品质的情况下，延长贮藏期，减少真空包装的酱卤豆干制品在保质期内的胀袋率，是目前值得探讨的问题[4]。本研究拟以真空包装腐败变质的酱卤豆干为研究对象，对引起其胀袋的细菌的种类和特性进行分析，并针对杀菌这一关键控制环节探索经济合理的灭菌参数，提出相应的防控措施，为保障酱卤豆干风味品质和延长货架期提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

待检样品。5个批次的保质期内存在胀袋现象的真空包装酱卤豆干制品，另选择保质期内无胀袋现象的真空包装酱卤豆干制品作为对照。

试剂。平板计数琼脂(PCA)、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、缓冲蛋白胨水(BPW)、BS琼脂、沙门氏菌显色培养基、BP琼脂、血平板、志贺氏菌显色培养基、革兰氏染色试剂套装等，均购自北京陆桥技术股份有限公司。

仪器与设备。HYC-310冷藏箱，青岛海尔特种电器有限公司；YP1002电子天平，上海津平科学仪器有限公司；SG2-EKJ酸度计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LRH-150生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；LMQ.C-80E立式灭菌器，山东新华医疗器械有限公司；DM1000正置显微镜，徕卡仪器有限公司；VITEK 2 Compact，梅里埃诊断产品(上海)有限公司。

1.2 方法

细菌检测。对胀袋酱卤豆干制品进行编号(样1～样5)，分别无菌称取25 g待检胀袋酱卤干制品，加入225 mL生理盐水拍打均质后，依次做10倍梯度稀释，取3个连续稀释度的菌悬液各1 mL于无菌平皿，加入冷却至50 ℃左右的PCA和VRBA各15 mL，混匀，每个稀释度做2个平行，PCA平板36 ℃倒置培养48 h，VRBA平板36 ℃倒置培养48 h，计数。选取适宜稀释度的平板挑取不同形态的单菌落分离纯化，染色观察。另取样品，按照相应国标(GB/T 4789—2016)方法对样品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行检测。

将上述PCA不同形态的单菌落接种LB增菌液，36 ℃培养24 h后，再在营养琼脂平板上纯化培养，挑取纯化后的单菌落进行VITEK2鉴定。

高压灭菌条件优化。取营养琼脂平板上纯化的单菌落接种LB增菌液，36 ℃恒温培养24 h，取每种纯菌种增菌液1 mL接种14包相同质量预先经高压灭菌处理(0.1 MPa 121 ℃灭菌30 min)的无胀袋现象的酱卤豆干制品，真空封袋，确保抽尽真空和完全密封，然后分为7组，分别按照100 ℃ 10 min、100 ℃ 15 min、110 ℃ 10 min、110 ℃ 15 min、121 ℃ 10 min、121 ℃ 15 min、121 ℃ 30 min进行灭菌(灭菌压力均为0.1 MPa)处理，并做好标记。将经过相同灭菌条件处理后的2份样品，一份称重后放入36 ℃生化培养箱恒温培养10 d，作为试验样品组；另外一份放入4 ℃冷藏箱作为对照样品组。随时观察试验组是否有胀袋、泄漏或腐败变质现象，如有，则及时取出检验。培养后对试验组样品进行称重，计算质量差。另取试验组和对照组样品，无菌碾碎，加入等量无菌纯化水，混匀后测量pH值，计算pH值差值。取试验组和对照组样品，用生理盐水稀释后，涂片，用结晶紫染色后干燥，显微镜观察至少5个视野，记录菌体形态特征以及每个视野内的菌落数，判断是否有明显的微生物增殖，若有，则无菌挑取小部分样品接种LB培养基进行增菌培养，再在营养琼脂平板上纯化培养，挑取纯化后的单菌落进行VITEK2鉴定。

2 结果与分析

2.1 细菌检测

检测结果显示，胀袋的真空包装的酱卤干制品样1～样5菌落总数分别为1.3×106、3.9×106、6.5×108、7.2×105、5.8×106g-1，而依据强制性国家标准GB 2711—2003《非发酵性豆制品及面筋卫生标准》，菌落总数应不超过750 g-1。VRBA平板上无菌落生长，报告大肠菌群数为<10 g-1。5份样品PCA平板上的菌落形态相似，均为圆形、较大、表面粗糙、似蜡样颜色的白色菌落(图1)，革兰氏染色后均为阳性杆菌，有芽孢，经VITEK2鉴定，结果均为蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。

图1 分离的菌落形态特征

2.2 致病菌检测

按照国标所载方法检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌，检测结果均为阴性，表明酱卤干制品中未受到上述3种致病菌的污染。

2.3 灭菌方法优化

如表1所示，经灭菌处理的试验组样品中，110 ℃ 15 min、121 ℃ 10 min、121 ℃ 15 min、121 ℃ 30 min组均无明显的胀袋、漏袋现象，36 ℃培养10 d前后质量差均小于1.0 g，pH差值均小于0.5，而100 ℃10 min、100 ℃ 15 min、110 ℃ 10 min灭菌处理组样品有轻微胀袋和腐败变质现象。显微镜观察显示，经121 ℃ 10 min、121 ℃ 15 min、121 ℃ 30 min灭菌处理各组样品无明显微生物增殖现象，经100 ℃ 10 min、100 ℃ 15 min、110 ℃ 10 min灭菌处理的样品有大量微生物增殖，110 ℃ 15 min处理的样品组有少许微生物增殖现象。无菌挑取上述细菌，经染色观察均为革兰氏阳性芽孢杆菌，经VITEK2鉴定结果显示为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。试验表明，121 ℃ 10 min灭菌即可杀灭蜡样芽孢杆菌的菌体及孢子，灭菌效果可满足真空包装储存的要求。

表1 各灭菌处理的效果

3 讨论

在卤制品加工和销售过程中，微生物是造成肉制品腐败、引发食源性疾病、缩短保质期的最主要因素[5]，因此，杀菌工序对产品的品质和保质期具有至关重要的作用。灭菌时间过长容易引发营养成分流失，高温产生的美拉德反应也会破坏产品风味；然而，高温灭菌过短即便能杀灭病原菌，也可能使耐热的芽孢菌残留，在之后的储存期间，一旦芽孢菌增殖，便会造成产品腐败变质，缩短货架期[5]。本试验对有胀袋现象的酱卤豆干制品中的微生物进行检测分析，结果显示，菌落总数出现比较严重的污染，但大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌均未检出。传统非发酵豆制品中常见污染微生物为耐热性芽孢菌属[6]，与本研究结果吻合。这是因为酱卤豆干制品在制作过程中，卤制工序可以杀死如假单胞菌、大肠菌群、乳杆菌、无色杆菌及致病性沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等绝大部分主要腐败微生物，而芽孢等耐热微生物有可能残留，若灭菌这一环节控制不好，则会导致耐热的芽孢等菌体存活。本研究对不同批次的5份样品进行微生物检测，仅分离得到1种引起胀袋的微生物，即蜡样芽孢杆菌，表明生产过程中可能存在灭菌不彻底的问题。对本研究分离的单菌落进行灭菌条件优化试验，从产品的风味、保质期和经济等角度出发，结合试验结果可知，121 ℃灭菌10 min即可杀灭蜡样芽孢杆菌菌体及芽孢，建议在生产中采用。

[1] 叶韬, 王云, 尹琳琳,等. 即食豆干加工过程中挥发性风味物质的研究[J]. 现代食品科技, 2016(6):271-280.

[2] 吕秋艳, 王志越, 刘玉珍,等. 市售非发酵性豆制品卫生质量现状调查[J]. 首都公共卫生, 2010, 4(2):77-78.

[3] 卜宇芳, 赵良忠, 尹乐斌,等. 卤豆干生产过程微生物检测及安全控制[J]. 食品科学, 2014, 35(5):107-110.

[4] 吴婷. 真空包装酱卤肉蛋制品微生物安全性监测[D].杭州：浙江大学, 2013.

[5] 毕旺来, 戴诗皎, 吴严,等. 1例真空包装卤鸭制品细菌污染的分析和工艺控制[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(31):19599-19601.

[6] 符克皇, 李佐雄, 高代平,等. 延长传统非发酵豆制品保质期的研究进展[J]. 保鲜与加工, 2011, 11(1):40-43.

收入日期：2017-08-04

江西省食品药品监督管理局科技计划(2015SP11)

翟平平(1987—)，女，湖北襄阳人，工程师，硕士，研究方向为食品微生物，E-mail:137600944@qq.com。

吴 鑫(1981—)，男，江西玉山人，工程师，硕士，研究方向为公共卫生检验，E-mail:jxyjwx@163.com。

文献著录格式：翟平平，朱应飞，范宏伟，等. 真空包装酱卤豆干制品腐败菌检测及灭菌工艺优化[J].浙江农业科学，2017，58(10)：1748-1750，1754.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171024

R155.5

A

0528-9017(2017)10-1748-03

(责任编辑高 峻)