HPLC同时测定鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量

曹 旭， 史培培， 童圣灵， 梁鹏飞， 蔡 芳， 胡 杨

(1.江苏吉贝尔药业股份有限公司， 江苏 镇江 212009； 2.镇江华康大药房连锁有限公司， 江苏 扬中 212200)

HPLC同时测定鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量

曹 旭1， 史培培2， 童圣灵1， 梁鹏飞1， 蔡 芳1， 胡 杨1

(1.江苏吉贝尔药业股份有限公司， 江苏 镇江 212009； 2.镇江华康大药房连锁有限公司， 江苏 扬中 212200)

采用高效液相色谱法同时测定鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量。色谱条件为：色谱柱为Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱，以甲醇(A)-体积分数0.1%甲酸水(B)梯度洗脱：0～17 min，22% A～42% A；17～28 min，42% A～56% A；28～40 min，56% A～90% A，检测波长为350 nm，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃。咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素分别在2.16～86.4 mg/L、6.445～257.8 mg/L和3.293～131.7 mg/L范围内线性关系良好,平均回收率分别为98.36%，99.42%和98.00%。该方法准确、可靠、重复性好，可用于鸭跖草提取物的质量评价与控制。

鸭跖草提取物； 咖啡酸； 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷； 异荭草素； 高效液相色谱法

鸭跖草为鸭跖草科植物鸭跖草(CommelinacommunisL.)的干燥茎叶部分，药性甘、淡、寒，归肺、胃、小肠经，具清热泻火、解毒、利水消肿之功效，常用于感冒发热、热病烦渴、咽喉肿痛、水肿尿少、热淋涩痛、痈肿疔毒的治疗[1-2]。鸭跖草始载于《本草拾遗》，现代药理研究表明，鸭跖草具有抗炎、降血糖、降血脂及抗氧化等药理作用[3-5]。近年有学者对鸭跖草的化学成分进行了研究[6-7]。在前期研究工作中采用HPLC-MS初步鉴定本试验中鸭跖草提取物的主要成分为咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素，而尚未对鸭跖草中此3种成分测定研究，故本研究采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)对鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量进行测定，为鸭跖草的新药开发及功能性保健产品的开发提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

LC-20A和SPD-20AT检测器(岛津株式会社)；N2000双通道色谱站(浙江大学智能信息工程研究所)；Buchi旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；微量移液器(北京大龙仪器公司)；超声清洗机(上海易净超声波仪器)。

1.2 材 料

咖啡酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110885-200102)；槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷对照品(上海源叶，纯度≥98%，批号：140528)；异荭草素对照品(上海纯优，纯度≥97%，批号：P0152)；鸭跖草提取物(自制，批号：20160903，20160924，20161011)；色谱纯甲醇(美国Tedia)；纯化水(自制)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相组成：甲醇(A)-体积分数0.1%甲酸水(B);梯度洗脱：0～17 min，22% A～42% A；17～28 min，42% A～56% A；28～40 min，56% A～90% A；流速：1 mL/min；柱温35 ℃；进样量：20 μL；检测波长：350 nm。

2.2 鸭跖草提取物的制备

称取鸭跖草适量，粉碎，过40目筛，加10倍量水，100 ℃回流提取2次，抽滤，合并两次提取液，减压浓缩至相对密度为1.15，加体积分数95%乙醇使含醇量达50%，醇沉静置12 h，离心去沉淀，上清减压浓缩除去乙醇，过HPD826大孔吸附树脂，依次用水及体积分数30%乙醇洗涤2个柱体积(BV)以除去水溶性杂质及部分醇溶性杂质，用体积分数75%乙醇洗脱5 BV，收集洗脱液，回收乙醇并真空干燥，干燥后经粉碎机粉碎，并过80目筛，备用。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液的配制

精密称取咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素对照品适量于量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成含咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素浓度分别为86.4、257.8、131.7 mg/L的混合对照品溶液储备液。分别吸取上述储备液5、2.5、1、0.5、0.25 mL于5个10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素浓度分别为2.16、4.32、8.64、21.6、43.2、86.4 mg/L，6.445、12.89、25.78、64.45、128.9、257.8 mg/L和3.293、6.585、13.17、32.93、65.85、131.7 mg/L的系列混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备

取鸭跖草提取物100 mg，精密称定，置入10 mL量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过后备用。

2.4 方法专属性

按2.1色谱条件进样分析，得到对照品和鸭跖草提取物的HPLC色谱图，见图1。在该色谱条件下，咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的分离度良好。

2.5 线性关系考察

取咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素浓度分别为86.4、43.2、21.6、8.64、4.32、2.16 mg/L，257.8、128.9、64.45、25.78、12.89、6.445 mg/L和131.7、65.85、32.93、13.17、6.585、3.293 mg/L的系列对照品溶液，按2.1色谱条件测定峰面积，并以峰面积(A)对对照品溶液浓度(C)进行线性回归，得标准曲线，结果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素分别在2.16～86.4 mg/L、6.445～257.8 mg/L和3.293～131.7 mg/L范围内线性关系良好，三者的回归方程分别为A=15 563C-2273.5(r=0.9998)，A=22 649C-2571.3(r=0.9998)，A=36 951C-17 225(r=0.9997)。

2.6 精密度试验

精密吸取含咖啡酸8.64 mg/L、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷25.78 mg/L和异荭草素13.17 mg/L的对照品溶液20 μL，按2.1色谱条件重复进样6次，记录三者峰面积，结果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素峰面积的RSD分别为0.71%、0.56%、0.72%，表明仪器精密度良好。

2.7 中间精密度试验

称取鸭跖草提取物(批号20160903)约100 mg，按2.3.2方法配制供试品溶液，分别由不同人员(A、B)在不同仪器(LC-20A、LC-2010AHT)用不同色谱柱(Phenomenex C18、Kromasil C18)操作，按2.1色谱条件进样，测得咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的平均含量分别为1.095、2.974、1.282 mg/g，三者含量的RSD分别为1.46%、0.87%、1.34%，表明方法中间精密度良好。

1.咖啡酸； 2.槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷； 3.异荭草素图1 鸭跖草提取物及对照品色谱图

2.8 重复性试验

称取鸭跖草提取物(批号：20160903)6份，每份约100 mg，按2.3.2方法配制供试品溶液，再按2.1色谱条件进样，记录咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的峰面积，计算三者含量。结果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素在鸭跖草提取物的含量分别为1.096、2.973、1.284 mg/g，三者含量的RSD分别为1.37%、1.05%、1.26%，均小于2%，表明方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取2.3.2供试品溶液，按2.1色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素峰面积，结果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素峰面积RSD分别为1.41%、0.98%、1.27%，均小于2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.10 加样回收率试验

称取已知含量的鸭跖草提取物(20160903批)6份(每份约50 mg)于10 mL容量瓶中，分别精密加入咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素浓度分别为43.2、128.9、65.85 mg/L的混合对照品溶液1 mL，加适量甲醇后超声溶解并定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，进样分析，记录峰面积，计算加样回收率及RSD值，结果见表1。

表1 加样回收率结果

2.11 样品测定

称取3批鸭跖草提取物各1份，每份100 mg，精密称定，按2.3.2方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定，记录峰面积，通过回归方程分别计算鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量。结果见表2。

表2 鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素含量

3 讨 论

3.1 检测波长的选择

咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷及异荭草素对照品分别经紫外全波长扫描，结果咖啡酸在323 nm波长处有最大吸收，槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷在368 nm波长处有最大吸收，异荭草素在350 nm 波长处有最大吸收，综合考虑后选择350 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

在选择流动相比例时，曾尝试采用甲醇-水等度洗脱系统同时测定咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素3种成分，结果分离效果较差或保留时间相对过长。因此，采用了甲醇-水梯度洗脱系统对鸭跖草提取物中3种成分进行检测，结果较为理想，同时加体积分数0.1%的甲酸调整峰型，结果峰型良好。

4 结 论

本研究采用HPLC同时测定鸭跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和异荭草素的含量，该方法快速、准确，重复性高，可用于鸭跖草提取物的质量评价与控制，为鸭跖草功能性产品的研究开发提供依据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：282.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：第5册[M].上海：上海科学技术出版社，1999：299-301.

[3] 余昕，朱烨，欧丽兰，等.鸭跖草抗炎活性部位筛选及抗炎机制[J].中成药，2015，37(8)：1824-1827.

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[7] 南海函，林函，蔡诗庆.鸭跖草化学成分的研究[J].中成药，2010，32(9)：1556-1558.

[责任编辑：谢 平]

Simultaneous determination of caffeic acid, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and isoorientin in extract ofCommelinacommunisL. by HPLC

CAO Xu1, SHI Pei-pei2, TONG Sheng-ling1, LIANG Peng-fei1, CAI Fang1, HU Yang1

(1.Jiangsu Jibrier Pharmaceutical Joint Stock Co., Ltd., Zhenjiang 212009, China;2.Zhenjiang Huakang Pharmacy Chain Co., Ltd., Yangzhong 212200, China)

The study uses HPLC method for simultaneous determination of the content of caffeic acid, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and isoorientin in extract ofCommelinacommunisL.. The HPLC analysis has been carried out on Phenomenex C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with methanol(A)-0.1% formic acid(B) gradient elution：0 min～17 min, 22% A～42% A;17 min～28 min, 42% A～56% A;28 min～40 min, 56% A～90% A at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength is 350 nm and the column temperature is 35 ℃. Good linear relationship has been found in the the range of 2.16～86.4 mg/L for caffeic acid, 6.445～257.8 mg/L for quercetin-3-O-α-L-rhamnoside, 3.293～131.7 mg/L for isoorientin. Their average recoveries are 98.36%, 99.42% and 98.00%, respectively. The method is accurate, reliable, and can be used for the quality control and evaluation of extract ofCommelinacommunisL..

extract ofCommelinacommunisL.; caffeic acid; quercetin-3-O-α-L-rhamnoside; isoorientin; HPLC

R284.1; O657.7+2

A

2096-3998(2017)05-0065-05

2017-06-02

2017-06-22

曹旭(1988—)，男，江苏省扬中市人，江苏吉贝尔药业股份有限公司工程师，硕士，主要研究方向为新药制剂及质量标准。