氢氯噻嗪和美托拉宗促进成骨样细胞增殖及成骨分化*

李 静，钱 欢，曾莹莹，凌君曼，曾 欣，呼海燕成都医学院 基础医学院(成都 610050)

·论著·

氢氯噻嗪和美托拉宗促进成骨样细胞增殖及成骨分化*

李 静，钱 欢，曾莹莹，凌君曼，曾 欣，呼海燕△
成都医学院 基础医学院(成都 610050)

目的观察钠氯共转运体(NCC)阻断剂氢氯噻嗪和美托拉宗阻断NCC后，对UMR106成骨样细胞增殖及成骨分化的影响。方法将细胞分为对照组、氢氯噻嗪组及美托拉宗组，分别加入不同浓度(1、10、100 M)的氢氯噻嗪及美托拉宗与UMR106细胞共培养，在不同时间点用MTT法检测细胞的增殖，碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ALP活性，实时荧光定量PCR法 (qRT-PCR)检测成骨相关因子Runx2和Osterix的mRNA表达。结果加药48 h后，1)氢氯噻嗪组在1 M与10 M浓度的吸光度(OD值)较对照组提高了(38.0±5.6)%和(30.3±3.3)%，差异有统计学意义(P<0.05)；美托拉宗组在1、10、100 M浓度的OD值较对照组提高(24.2±1.8)%、(50.8±6.6)%及(26.8±2.1)%，差异有统计学意义(P<0.05)；2)氢氯噻嗪组和美托拉宗组在1、10、100 M浓度的ALP活性较对照组分别提高了(169.6±19.8)%、(86.6±8.7)%、(118.2±12.5)% 以及(73.4±6.8)%、(145.6±14.5)%、(63.0±7.9)%，差异均有统计学意义(P<0.05)；3)加药培养24 h后，氢氯噻嗪组和美托拉宗组在1、10、100 M浓度Runx2 mRNA的表达增多，分别是对照组的(3.52±0.31)、(2.85±0.15)、(2.50±0.41)倍及(2.05±0.45)、(4.57±0.98)、(2.93±0.34)倍，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论氢氯噻嗪和美托拉宗在加药24 h可提高Runx2 mRNA的表达，48 h促进细胞增殖及ALP活性。两药可能通过上调成骨相关因子Runx2 mRNA的表达促进UMR106细胞的增殖及成骨分化。

钠氯共转运体；氢氯噻嗪；美托拉宗；UMR106成骨样细胞；增殖

钠氯共转运体(NCC)是一种阳离子偶联氯化物协同转运蛋白[1]，存在于肾脏[2]、小肠[3]和骨组织[4]等，但主要表达于肾脏远曲小管的管腔膜，是肾脏远曲小管主要的钠离子重吸收通道，其特异性阻断剂噻嗪类药物作为高血压治疗的一线药物，在世界范围内广泛使用[5]。研究[6]发现，长期接受噻嗪类利尿剂治疗的高血压患者其骨密度高于其他药物治疗组，这一效应通常被认为由肾脏主导[7]。由于NCC在成骨细胞也有表达[4, 8]， 国外研究[4, 9]提示噻嗪类利尿剂可影响成骨细胞的成骨分化，但研究结果分歧较大， 国内则鲜见相关研究报道。由于NCC阻断剂对成骨代谢的正性调节作用，使之成为骨质疏松症的潜在治疗靶点，对相关药物的作用机制进行深入研究具有重要的临床意义。本研究使用临床常用的两类NCC阻断剂氢氯噻嗪及美托拉宗干预UMR106细胞的培养，观察其对细胞增殖的影响，并探索药物的最佳作用时间及浓度，旨在为临床骨质疏松症提供新的治疗策略与药物选择。

1 材料与方法

1.1UMR106细胞的培养及分组

将UMR106细胞(大鼠骨肉瘤细胞，由四川大学华西口腔医学院陈雨雪教授惠赠)接种于含10%新生牛血清(杭州四季青公司)和2%双抗(美国Billab公司)的DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)中，置于37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱(上海一恒科技公司)内培养，细胞贴壁后每1～2 d换液1次，待细胞汇合至80%～90%时使用0.25%胰蛋白酶(美国Sigma公司)消化，按1∶2传代。实验分组：1)空白对照组：细胞接种培养后，加入不含血清的DMEM高糖培养基；2)氢氯噻嗪组：细胞接种培养后，分别加入含不同浓度(1、10、100 M )氢氯噻嗪(美国TargetMol公司)的无血清DMEM高糖培养基；3)美托拉宗组：细胞接种培养后，分别加入含不同浓度(1、10、100 M )美托拉宗(美国TargetMol公司)的无血清DMEM高糖培养基。

1.2MTT法检测细胞增殖

将处于对数生长期的UMR106细胞消化并计数后，按5 103/孔的浓度接种于96孔板，置培养箱培养24 h，待细胞贴壁后吸去培养基，按1.1 所述方法分组加药，每组6个复孔。继续培养24、48、72 h后，弃培养基，毎孔加入20 μL MTT(美国Sigma公司)和180 μL不含血清的DMEM培养基，孵育4 h后弃上清液，加入150 μL DMSO，振荡10 min后，使用酶标仪(美国Bio-Rad公司)在490 nm处测吸光度(OD)值。

1.3ALP活性检测

将处于对数生长期的细胞按2 104/孔的浓度接种于24孔板中，培养及分组加药同前，每组6个复孔。加药培养24、48 h后，弃培养基，按ALP试剂盒(上海碧云天科技公司)操作步骤检测ALP活性：加入0.2%的Triton x-100 裂解，离心取上清， 取50 μL上清液加入50 μL显色底物，37 ℃孵育5～10 min，加入100 μL反应终止液终止反应，在405 nm处测OD值。使用标准品绘制标准曲线，计算碱性磷酸酶活性。

1.4qRT-PCR检测Runx2及Osterix的mRNA表达

将处于对数生长期的细胞按5 104/孔的浓度接种于6孔板中，培养及分组加药同前，每组4个复孔。加药培养24 h后，弃培养基，加入RNAISO plus(日本Takara公司)裂解细胞，经氯仿分离、异丙醇沉淀、75%乙醇漂洗提取总RNA，使用分光光度计(美国Thermo-Scientific公司)测RNA浓度及A260/A280的比值判断提取质量。按反转录试剂盒(日本Takara公司)操作步骤将总RNA反转录为cDNA，采用 SYBR green 染料法(日本Takara公司)，实时荧光定量PCR (qRT-PCR，美国Bio-Rad公司)检测各组细胞Runx2及Osterix的mRNA表达，β-actin作为内参。反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃， 3 min 反应1个循环，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，共反应40个循环, 65 ℃ 5 s。引物序列如下：Runx2的正向引物序列为：5'-CCGTGTCAGCAAAACTTCTT-3'，反向引物序列为：5'-CTCACGTCGCTCATCTTGC-3'；Osterix的正向引物序列为：5'-GGACAGCCAACCCTAGCC-3'，反向引物序列为：5'-TGGAGCCACCAAA CTTGC-3'；β-actin的正向引物序列为：5'-CCCGCGAGTACAACCTTCT-3'，反向引物序列为：5'-CGTCATCCATGGCGAACT-3'，引物由成都擎科生物公司合成。反应结束后，使用溶解曲线判断特异性，将各样本的Ct值与β-actin内参基因做对照，定量采用2-△△Ct法。

1.5统计学方法

2 结果

2.1氢氯噻嗪和美托拉宗促进UMR106细胞增殖

加入药物培养24 h后，与对照组相比，两种药物在1 M及10 M 浓度对细胞增殖均无影响；但在100 M浓度，氢氯噻嗪和美托拉宗对细胞增殖均产生了抑制作用，OD值较对照组分别下降了21.4%和20.1%，差异有统计学意义(P<0.01)。培养48 h后，加药组及对照组细胞增殖均较24 h明显提高，且加药组高于对照组。氢氯噻嗪组在1 M与10 M浓度的OD值较对照组分别提高了(38.0±5.6)%和(30.3±3.3)%， 差异有统计学意义(P<0.05)；虽然氢氯噻嗪组在100 M浓度也高于对照组(23.5±4.2)%，但差异无统计学意义(P>0.05)。 美托拉宗组在1、10、100 M浓度的OD值较对照组分别提高了(24.2±1.8)%、(50.8±6.6)%及(26.8±2.1)%，差异均有统计学意义(P<0.05)。加药培养72 h后，各组细胞增殖均较48 h降低。与对照组相比，氢氯噻嗪组在1 M浓度及美托拉宗组在1、10 M浓度的OD值分别提高了(18.6±1.1)%、(17.2±1.9)%及(27.0±2.2)%，差异有统计学意义(P<0.05)；但其他组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

2.2氢氯噻嗪和美托拉宗提高UMR106细胞ALP活性

与细胞增殖的作用相似，加药培养24 h后，各组细胞ALP活性与对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；培养48 h后，各组ALP活性均较24 h明显提高，氢氯噻嗪组在1、10、100 M浓度的ALP活性较对照组分别提高了(169.6±19.8)%、(86.6±8.7)%及(118.2±12.5)%，美托拉宗组在1、10、100 M浓度的ALP活性较对照组分别提高了(73.4±6.8)%、(145.6±14.5)%、(63.0±7.9)%，差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)。由于细胞增殖结果提示在72 h细胞的增殖较48 h下降，故未检测72 h的ALP活性 。

2.3氢氯噻嗪和美托拉宗对细胞Runx2和OsterixmRNA表达的影响

加药培养24 h后，与对照组相比，氢氯噻嗪和美托拉宗组在各浓度对成骨相关因子Runx2 mRNA的表达均显著提高，在1 M、10 M及100 M组，Runx2 mRNA表达分别是对照组的(3.52±0.31)、(2.85±0.15)、(2.50±0.41)倍及(2.05±0.45)、(4.57±0.98)、(2.93±0.34)倍，差异均有统计学意义(P<0.05)；氢氯噻嗪和美托拉宗组对成骨相关因子Osterix mRNA表达略有上调，但差异均无统计学意义(P>0.05)(图3)。

图1 氢氯噻嗪和美托拉宗对UMR106细胞增殖的影响

注：A：氢氯噻嗪在各时间点对共培养的UMR106细胞增殖的影响；B：美托拉宗在各时间点对共培养的UMR106细胞增殖的影响；与对照组相比，*P<0.05 ，**P<0.01(n=6)

注：A：氢氯噻嗪在各时间点对共培养的UMR106细胞ALP活性的影响；B：美托拉宗在各时间点对共培养的UMR106细胞ALP活性的影响；与对照组相比，*P<0.05 ，**P<0.01 (n=6)

图3 氢氯噻嗪和美托拉宗对UMR106细胞Runx2和Osterix mRNA表达的影响

注：A：氢氯噻嗪在24 h对共培养的UMR106细胞成骨相关因子Runx2和Osterix mRNA表达的影响；B：美托拉宗 在24 h对共培养的UMR106细胞成骨相关因子Runx2和Osterix mRNA表达的影响；与对照组相比，*P<0.05 ，**P<0.01 (n=4)

3 讨论

NCC 是肾脏远曲小管主要的钠离子重吸收通道，其特异性阻断剂噻嗪类药物是高血压治疗的一线药物[5]。 研究[6]发现阻断NCC功能可增加骨密度，表现为：在高血压的治疗中，使用噻嗪类利尿剂治疗组患者的骨密度较其他药物治疗组提高，骨折风险降低；因基因突变致NCC功能失活而导致的Gitelman综合征患者的骨密度较正常同龄人增加[8]；NCC基因敲除鼠的骨密度高于野生型小鼠[10]。NCC功能阻断后骨密度增加的效应通常认为由肾脏主导，因为使用噻嗪类利尿剂可下调肾脏远曲小管钠钙交换，减少尿钙排泄[7]，从而增加骨密度。但这一解释也受到一些质疑，因为即使长期使用(2年以上)氢氯噻嗪的患者其血钙含量并无明显变化，而在NCC失活导致的Gitelman综合症患者中甚至会出现低钙血症[4]。由于NCC在成骨细胞也有表达[4, 8]，噻嗪类药物能否直接通过促进成骨而提高骨密度成为新的研究点，近年来国外对此作了相关的研究，如Lajeunesse 等[9]报道氢氯噻嗪可上调人成骨细胞系MG-63骨钙素的表达，Dvorak 等[4]报道美托拉宗可促进成骨细胞成骨分化及钙结节形成，但对成骨细胞的增殖及碱性磷酸酶(ALP)表达作用分歧较大[4, 9]。

骨代谢是由成骨细胞介导的骨形成及由破骨细胞介导的骨吸收的动态平衡[11]，随着年龄的增长，成骨细胞的功能下降并伴随破骨细胞功能的增强，将导致以骨密度降低为特征的骨质疏松症[12]。随着我国进入老龄化社会，骨质疏松症日益成为严重的公共健康问题。骨质疏松症的治疗手段现大多局限于抑制破骨细胞的功能，而缺乏促进成骨细胞功能的药物[11]，因此，研究NCC特异性阻断剂对UMR106成骨样细胞的作用机制具有重要的临床意义。本次研究使用了临床常用的NCC阻断剂氢氯噻嗪和美托拉宗，二者化学结构不同但均作用于NCC，通过与UMR106细胞的共培养来研究药物对成骨样细胞增殖及成骨分化的影响， 旨在为进一步的实验及治疗提供研究基础。

结果表明，氢氯噻嗪和美托拉宗均可促进UMR106细胞的增殖，加药培养48 h效果最为显著，氢氯噻嗪在1 M和10 M组促进了细胞的增殖，美托拉宗各组均促进细胞的增殖。其他研究[4, 9]关于噻嗪类药物对成骨细胞的增殖作用分歧较大，或与其检测时间点及方法不同有关，如在Dvorak等[4]研究中并未发现美托拉宗对成骨细胞的增殖产生影响，其使用的方法为细胞计数板直接计数细胞，且检测时间长达7 d。本研究为排除血清因素的干扰，加药组与对照组均使用无血清培养，结果显示，氢氯噻嗪和美托拉宗均促进成骨细胞增殖，最佳效应为48 h，在72 h后作用均有所下降，推测原因可能与无血清培养有关。故在ALP及成骨分化相关基因Runx2和Osterix mRNA表达实验中均未做72 h的表达。在后续实验中将比较加入血清培养后药物的作用是否与无血清培养作用一致。另外，高浓度(100 M)的氢氯噻嗪和美托拉宗对细胞增殖作用在各时间点的差异较大，加药培养24 h，两药对细胞增殖均产生了抑制作用，继续培养48 h和72 h，氢氯噻嗪组细胞增殖与对照相比差异无统计学意义(P>0.05)；美托拉宗组培养48 h后OD值明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，72 h后OD值差异无统计学意义(P>0.05)。推测原因可能为两种药物在高浓度时对细胞的初期作用为抑制，随着细胞继续培养逐渐适应，这种抑制作用也逐渐减弱甚至表现为微弱的促进作用。有关这一现象产生的机制，仍需进一步探讨。

ALP是成骨细胞分化的特征性酶，其活性可反映成骨细胞的成骨分化和增殖程度[13]，结果显示，氢氯噻嗪和美托拉宗均可提高UMR106细胞的ALP活性，该效应的作用时间及浓度与细胞增殖效应一致，也是在48 h作用最为显著，提示氢氯噻嗪和美托拉宗可能通过促进成骨细胞增殖进而提高ALP的活性。

为探索氢氯噻嗪和美托拉宗促进成骨细胞增殖的基因调控机制，本研究检测了成骨相关因子Runx2 (核心结合因子α1)和Osterix (锌指结构转录因子)mRNA的表达。Runx2 和Osterix 为骨发育和骨形成的关键因子，可调控成骨细胞的增殖与分化[14]， 促进成骨细胞的成熟和胞外基质的分泌，是骨形成过程中所必需的关键物质[15-16]。结果显示，加药培养24 h后，氢氯噻嗪和美托拉宗显著提高了Runx2 mRNA表达；但对Osterix mRNA表达无影响，推测原因可能为Osterix在发育的骨组织中特异性表达，在骨发育形成的后期起到重要的调节作用[16]，故在24 h并未检测到该基因表达的差异。

综上所述，NCC功能阻断剂氢氯噻嗪和美托拉宗可能通过上调成骨相关因子Runx2 mRNA的表达促进UMR106细胞的增殖与成骨分化，促进成骨代谢。该结果或可部分解释使用噻嗪类利尿剂治疗高血压患者骨密度高于其他药物治疗组，对于临床高血压病合并骨质疏松症患者制定治疗方案，以及对促进成骨代谢的药物开发具有一定的指导意义。

[1]Gamba G. The thiazide-sensitive Na+-Cl-cotransporter: molecular biology, functional properties, and regulation by WNKs[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 297(4): F838-F848.

[2]Gamba G. Regulation of the renal Na+-Cl-cotransporter by phosphorylation and ubiquitylation[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2012, 303(12): F1573-F1583.

[3]Bazzini C, Vezzoli V, Sironi C,etal. Thiazide-sensitive NaCl-cotransporter in the intestine: possible role of hydrochlorothiazide in the intestinal Ca2+ uptake[J]. J Biol Chem, 2005, 280(20): 19902-19910.

[4]Dvorak M M, De Joussineau C, Carter D H,etal. Thiazide diuretics directly induce osteoblast differentiation and mineralized nodule formation by interacting with a sodium chloride co-transporter in bone[J]. J Am Soc Nephrol, 2007, 18(9): 2509-2516.

[5]Rojas-Vega L, Gamba G. Mini-review: regulation of the renal NaCl cotransporter by hormones[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2016, 310(1): F10-F14.

[6]Weiland S. Injuries. Thiazide diuretics and the risk of hip fracture among 70-79 year old women treated for hypertension[J]. Eur J of Public Health, 1997(3): 335-340.

[7]Nijenhuis T, Hoenderop J G, Loffing J,etal. Thiazide-induced hypocalciuria is accompanied by a decreased expression of Ca2+ transport proteins in kidney[J]. Kidney Int, 2003, 64(2): 555-564.

[8]Nicolet-Barousse L, Blanchard A, Roux C,etal. Inactivation of the Na-Cl co-transporter (NCC) gene is associated with high BMD through both renal and bone mechanisms: analysis of patients with Gitelman syndrome and Ncc null mice[J]. J Bone Miner Res, 2005, 20(5): 799-808.

[9]Lajeunesse D, Delalandre A, Guggino S E. Thiazide diuretics affect osteocalcin production in human osteoblasts at the transcription level without affecting vitamin D3 receptors[J]. J Bone Miner Res, 2000, 15(5): 894-901.

[10] Hsu Y J, Yang S S, Cheng C J,etal. Thiazide-sensitive Na+-Cl-cotransporter (NCC) gene inactivation results in increased duodenal Ca2+ absorption, enhanced osteoblast differentiation and elevated bone mineral density[J]. J Bone Miner Res, 2015, 30(1): 116-127.

[11] Seeman E. Bone quality: the material and structural basis of bone strength[J]. J Bone Miner Metab, 2008, 26(1): 1-8.

[12] Kanis J A, Melton L J 3rd, Christiansen C,etal. The diagnosis of osteoporosis[J]. J Bone Miner Res, 1994, 9(8): 1137-1141.

[13] Kakita A, Suzuki A, Ono Y,etal. Possible involvement of p38 MAP kinase in prostaglandin E1-induced ALP activity in osteoblast-like cells[J]. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 2004, 70(5): 469-474.

[14] Pérez-Campo F M, Santurtún A, García-Ibarbia C,etal. Osterix and RUNX2 are Transcriptional Regulators of Sclerostin in Human Bone[J]. Calcif Tissue Int, 2016, 99(3): 302-309.

[15] Lee K S, Kim H J, Li Q L,etal. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12[J]. Mol Cell Biol, 2000, 20(23): 8783-8792.

[16] Nakashima K, Zhou X, Kunkel G,etal. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation[J]. Cell, 2002, 108(1): 17-29.

AStudyontheProliferationandDifferentiationofOsteoblast-likeCellsPromotedbyHydrochloridethiazideandMetolazone

LiJing,QianHuan,ZengYinyin,LinJunman,ZengXin,HuHaiyan△.
SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo investigate the effect of the sodium and chloride co-transporter (NCC) blockers Hydrochlorothiazide (HCTZ) and Metolazone on the proliferation and osteoblast differentiation of UMR106 cells.MethodsThe Cells were divided into the control group, HCTZ group and metolazone group. HCTZ and Metolazone of different concentration (1M, 10M and 100M) were co-cultured with UMR106 cells respectively. The cell proliferation, ALP activity, and expression of Runx2 and Osterix mRNA were detected by the MTT method, ALP kit, and qRT-PCR repectively at different time points.ResultsCompared with the control group after 48 hours of being co-cultured, the OD values in the HCTZ groups with the concentration of 1M and 10M increased by (38.0±5.6)% and (30.3±3.3)% respectively and those in the Metolazone groups with the concentration of 1M, 10M and 100M increased by (24.2±1.8)%, (50.8±6.6)% and (26.8±2.1)% respectively, and the differences were statistically significant (P<0.05). The ALP activities in the HCTZ groups with the concentration of 1M, 10M and 100M increased by (169.6±19.8)%, (86.6±8.7)% and (118.2±12.5)%, and those in the Metolazone groups with the concentration of 1M, 10M and 100M increased by (73.4±6.8)%, (145.6±14.5)% and (63.0±7.9)% respectively, and the differences were statistically significant (P<0.05). Compared with the control group after 48 hours of being co-cultured, the expression levels of Runx2 and Osterix mRNA in the HCTZ groups with the concentration of 1M, 10 M and 100 M increased to (3.52±0.31)times, (2.85±0.15)times and (2.50±0.41)times, and the those in the Metolazone groups with the concentration of 1M, 10M and 100M increased to (2.05±0.45)times, (4.57±0.98)times and (2.93±0.34)times, and the differences were statistically significant (P<0.05).ConclusionHCTZ and metolazone significantly increase the expression of Runx2 mRNA after 24 hours of being co-cultured and promote the cell proliferation and ALP activity after 48 hours of being cocultured. Both drugs may promote the proliferation and osteoblast differentiation of UMR106 cells by up-regulating the expression of osteogenesis-related factor Runx2 mRNA.

Sodium and Chloride co-transporter; Hydrochlorothiazide; Metolazone; UMR106 osteoblast-like cells; Proliferation

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171009.1545.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.05.007

R681

A

四川省教育厅自然科学基金资助项目(No:17ZA0115)；大学生创新创业训练计划项目(No:201513705020；No:201613705007)

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呼海燕，E-mail:hyhoo@163.com