Graves病患者血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17相关细胞因子表达变化及意义

王建国 ，史春云 ，丑广程 ，陈占良 ，冯惠清 ，王淑仙

（1.河北大学附属医院 检验科，河北 保定 071000；2.河北省保定市儿童医院 内三科，河北 保定 071051）

新进展研究·论著

Graves病患者血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17相关细胞因子表达变化及意义

王建国1，史春云2，丑广程1，陈占良1，冯惠清1，王淑仙1

（1.河北大学附属医院 检验科，河北 保定 071000；2.河北省保定市儿童医院 内三科，河北 保定 071051）

目的探讨Graves病患者血清Toll样受体4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）和调节性T细胞/辅助性T细胞17（Treg/Th17）相关细胞因子表达变化及意义。方法选取62例初步确诊为Graves病的患者和45例健康者（对照组），采用电化学发光法检测血清中促甲状腺素（TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离四碘甲状腺原氨酸（FT4）和促甲状腺素受体抗体（TRAb）水平，利用双抗体酶联免疫吸附试验（ELISA法）对血清中TLR4、NF-κB、TGF-β1、IL-10、IL-6和IL-17水平进行检测。结果Graves病患者血清TSH水平低于对照组，而血清FT3、FT4和TRAb水平则高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Graves病患者血清TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和IL-17水平均高于对照组，而TGF-β1水平则低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Pearson相关分析显示，Graves病患者血清 TSH 与 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和 IL-17均呈负相关（P＜0.05），而与 TGF-β1呈正相关（P＜0.05），血清 FT3和 FT4均与 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和 IL-17呈正相关（P＜0.05），而与TGF-β1呈负相关（P＜0.05）；Graves病患者血清TLR4与NF-κB呈正相关（P＜0.05），且与IL-10、IL-6和IL-17呈正相关（P＜0.05），而与TGF-β1呈负相关（P＜0.05）。结论Graves病患者血清TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和IL-17水平升高，而TGF-β1水平降低，NF-κB信号通路激活和Treg/Th17平衡失调可能共同参与Graves病发病过程。

Graves病；Toll样受体4；核因子-κB；调节性T细胞/辅助性T细胞17；细胞因子

Graves病作为临床常见病和多发病，是一种器官特异性免疫性疾病，约80%～86%的甲状腺功能亢进症（甲亢）是由该病引起，并可导致多器官损害[1]，该病发病年龄不具有特异性，且近年来发病率呈上升趋势，严重影响患者生存质量[2]。目前，该病发生机制尚未完全清楚，有研究指出[3]，细胞免疫功能紊乱与Graves病发生及进展密切相关。而免疫细胞发挥作用则主要是通过相关细胞因子发挥作用[4]，有研究指出[5]，Toll样受体 4（toll-like receptor 4，TLR4）、核因子 κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信号通路在自身免疫性疾病发生中发挥重要作用。CD4+、CD25+调节性 T 细胞（CD4+，CD25+regulatory T cells，Treg）/辅助性 T 细胞 17（T helper cell 17，Th17）作为新近发现的CD4+细胞重要的亚群，其平衡在免疫调节及与免疫相关疾病发生中发挥重要作用[6]。本研究拟对初诊Graves病患者血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17相关细胞因子表达水平进行分析，探讨该病发病中的意义，以期为临床实践提供基础资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年2月-2016年8月在本院确诊为Graves病的患者62例。其中，男性22例，女性40例；平均年龄（38.7±10.6）岁。病例纳入标准：①均符合《中国甲状腺疾病诊治指南》[7]；②年龄19～65岁；③均未接受过Graves病相关治疗。排除标准：①既往糖尿病史、肝功能异常和血液系统疾病者；②合并其他自身免疫系统疾病者；③急慢性感染、恶性肿瘤、妊娠和过敏性疾病，以及近30 d内使用过糖皮质疾病者。同期，从医院体检中心选取健康者45例作为对照组，均排除甲状腺疾病和家族史者、自身免疫性疾病者和使用免疫抑制剂者。其中，男性17例，女性28例；平均年龄（39.4±11.2）岁。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 所有研究对象均抽取晨起空腹静脉血 6 ml，＜30 min 于 3 000 r/min 离心 15 min，留取血清，置于-70℃冰箱冷冻保存备检。

1.2.2 实验室检测 采用电化学发光法检测血清中甲状腺激素[促甲状腺素（thyrotropin，TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、游离四碘甲状腺原氨酸（free tetraiodothyronine，FT4）和促甲状腺素受体抗体（thyrotropin receptor antibody，TRAb）]水平，利用双抗体酶联免疫吸附试验（ELISA法）对血清中TLR4、NF-κB、人转化生长因子β1（human transforming growth factor beta1，TGF-β1）、白细胞介素 10（interleukin，IL-10）、IL-6 和 IL-17 水平进行检测，试剂盒购自上海酶远生物公司，所有操作均按照试剂盒说明书在标准实验室内完成。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，相关分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料和甲状腺功能

Graves病患者和对照组在性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05），Graves病患者血清TSH水平低于对照组，而血清FT3、FT4和TRAb水平则高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组血清 TLR4、NF-κB、TGF-β1、IL-10、IL-6和IL-17水平

Graves病患者血清 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和IL-17水平均高于对照组，而TGF-β1水平则低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 甲状腺功能与血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17的相关性

Pearson相关分析显示，Graves病患者血清TSH与 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6 和 IL-17 均呈负相关（P＜0.05），而与 TGF-β1呈正相关（P＜0.05）；血清FT3和 FT4均与 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6 和 IL-17呈正相关（P＜0.05），而与 TGF-β1呈负相关（P＜0.05）。见表 3。

2.4 Graves病患者血清TLR4、NF-κB与Treg/Th17相关细胞因子的相关性

Graves病患者血清TLR4与NF-κB呈正相关（P＜0.05），且均与IL-10、IL-6和IL-17呈正相关（P＜0.05），而与 TGF-β1呈负相关（P＜0.05）。见表 4。

表1 两组一般资料和甲状腺功能比较

表2 两组血清 TLR4、NF-κB、TGF-β1、IL-10、IL-6和 IL-17比较

表3 甲状腺功能与血清TLR4、NF-κB和Treg/Th17的相关性

表4 Graves病患者血清TLR4、NF-κB与Treg/Th17相关细胞因子的相关性

3 讨论

Graves病发病较为复杂，是环境、遗传和自身免疫功能紊乱等多种因素导致的甲状腺发生特异性自身免疫反应，出现弥漫性甲状腺肿，甲状腺功能亢进[8]。本研究对初次确诊而未治疗的Graves病患者甲状腺功能检测发现，Graves病患者血清TSH水平低于对照组，而血清FT3、FT4和TRAb水平则高于对照组，说明Graves病患者出现甲状腺功能紊乱，且血清中出现TRAb等自身抗体，提示免疫功能异常参与Graves病发病过程。

TLR4作为Ⅰ型跨膜糖蛋白，可与相应的受体结合，在下游信号传导中发挥重要作用，参与细菌感染及自身免疫性疾病的发生[9]。有研究指出[10]，TLR4引发的胞内信号通路可导致NF-κB活化，激活炎症转录程序，进而大量释放细胞炎症因子，产生级联炎症反应。NF-κB几乎在所有类型细胞及组织中均存在，在多种炎症反应信号通路中发挥重要作用，是调节炎症反应和免疫反应的关键性核转录因子[11]。本研究显示，Graves病患者血清TLR4、NF-κB水平均高于对照组，说明TLR4/NF-κB可能参与Graves病发病过程，相关分析亦显示，Graves病患者血清TLR4与NF-κB呈正相关，血清TSH与TLR4、NF-κB均呈负相关血清FT3和FT4均与TLR4、NF-κB呈正相关，进一步说明TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症反应可能参与Graves病发病及进展过程。

Treg作为维持免疫稳态的重要细胞，可通过细胞接触或分泌如TGF-β、IL-10等相关细胞因子，而在负性调节免疫应答、维持免疫耐受及防止自身免疫发生中发挥重要作用[12]，Th17作为CD4+T细胞中不同于Th1、Th2的细胞亚群，可被TGF-β等诱导分化，同时被IL-6增强，可通过产生IL-17而参与感染性疾病及免疫系统疾病发生[13]。研究表明[14]，Treg/Th17动态平衡维持免疫功能的稳定。本研究显示，Graves病患者血清IL-10、IL-6和IL-17水平均高于对照组，而TGF-β1水平则低于对照组，间接反映出Graves病患者Treg/Th17动态平衡可能被打破，出现自身免疫抑制功能下降，但血清中IL-10水平未降低反而升高，笔者分析，可能是Treg虽可分泌IL-10，但并非IL-10的唯一来源，Th2及Th9细胞亦可以分泌IL-10[15]，从而导致血清中IL-10水平不升反降。Pearson相关分析显示，Graves病患者血清TSH与IL-10、IL-6和IL-17均呈负相关，而与TGF-β1呈正相关，血清 FT3和 FT4均与 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6 和IL-17呈正相关，而与TGF-β1呈负相关，进一步说明了Treg/Th17分泌的细胞因子参与Graves病发病过程，可能与Graves病病程进程密切相关。有研究指出[16]，IL-17和NF-κB信号通路相互关系，IL-17可激活NF-κB信号通路而诱导炎症因子的释放，参与类风湿性关节炎的发生。有研究指出[17]，Th17/IL-23通路是经由NF-κB而参与银屑病致病。本研究相关分析显示，Graves病患者血清TLR4与NF-κB呈正相关，且均与IL-10、IL-6和IL-17呈正相关，而与TGF-β1呈负相关，说明TLR4/NF-κB信号通路参与Graves病发病过程，同时Treg/Th17产生的相关细胞因子亦可能通过NF-κB信号通路而参与Graves病发病，但具体作用机制尚待进一步研究明确。

综上所述，Graves病患者血清 TLR4、NF-κB、IL-10、IL-6和IL-17水平升高，而TGF-β1水平降低，NF-κB信号通路激活和Treg/Th17平衡失调可能共同参与Graves病发病过程，但具体相互作用机制有待进一步明确。

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Involvement of circulating TLR4,NF-κB and Treg/Th17 related cytokines in Graves'disease

Jian-guo Wang1,Chun-yun Shi2,Guang-cheng Chou1,Zhan-liang Chen1,Hui-qing Feng1,Shu-xian Wang1
(1.Department of Laboratory,Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding,Hebei 071000,China;2.Department of Children's Internal Medicine,Baoding Children's Hospital,Baoding,Hebei 071051,China)

ObjectiveTo investigate the concentration of Toll-like receptor 4 (TLR4),nuclear factor κB(NF-κB)and regulatory T cells (Treg)/T helper cell 17 (Th17)related cytokines in patients with Graves'disease and their potential correlations.MethodsA total of 62 patients initially diagnosed with Graves'disease and 45 healthy volunteers were involved in this study.The serum levels of thyroid stimulating hormone(TSH),free triiodothyronine(FT3),free tetraiodothyronine(FT4)and thyrotropin receptor antibody(TRAb)were measured by Electrochemiluminescence.The serum levels of TLR4,NF-κB,transforming growth factor β(TGF-β),interleukin 10(IL-10),interleukin 6(IL-6)and interleukin 17(IL-17)were measured by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).ResultsThe serum levels of TSH in patients were increased while FT3,FT4and TRAb were decreased significantly when compared with those in volunteers (P＜0.05).Bloodconcentration of TLR4,NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17 in patients was upregulated while concentration of TGF-β1was downregulated in comparison with the healthy control group (P ＜ 0.05).Pearson correlation analysis showed that TSH was negatively correlated with TLR4,NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17 (P ＜ 0.05),but positively correlated with TGF-β1(P ＜ 0.05).FT3and FT4 were positively correlated with TLR4,NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17,but negatively correlated with TGF-β1(P＜0.05).TLR4 was positively correlated with NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17(P＜0.05),but negatively correlated with TGF-β1(P＜0.05).ConclusionsThe serum levels of TLR4,NF-κB,IL-10,IL-6 and IL-17 in patients with Graves'disease are increased while level of TGF-β1is decreased.Activation of NF-κB signaling pathway and Treg/Th17 imbalance might be involved in the pathogenesis of Graves'disease.

Graves'disease;toll-like receptor 4;nuclear factor kappa B;CD4+,CD25+regulatory T cells/T helper cell 17;cytokines

R581.4

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.012

1005-8982（2017）24-0058-04

2017-02-20

王淑仙，E-mail：402767260@qq.com；Tel：13111666605

（唐勇 编辑）