诱导型一氧化氮合酶和缺氧诱导因子-1α与尖锐湿疣发生、发展的相关性研究

吴然 ，贾敏 ，唐挺 ，马尊峰 ，贺爱娟 ，孙蔺波 ，胡文韬 ，曾义燕 ，冯浩

（1.贵阳中医学院第一附属医院 皮肤科，贵州 贵阳 550001；2.湖南省人民医院 皮肤科，湖南 长沙 410005）

诱导型一氧化氮合酶和缺氧诱导因子-1α与尖锐湿疣发生、发展的相关性研究

吴然1，贾敏1，唐挺1，马尊峰1，贺爱娟1，孙蔺波1，胡文韬1，曾义燕1，冯浩2

（1.贵阳中医学院第一附属医院 皮肤科，贵州 贵阳 550001；2.湖南省人民医院 皮肤科，湖南 长沙 410005）

目的检测尖锐湿疣（CA）组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达，以明确其在CA发生、发展中的临床意义。方法收集50例CA和20例正常包皮组织，采用免疫组织化学法检测组织中iNOS与HIF-1α的表达并与CD34表达进行相关分析。结果50例CA患者中，iNOS阳性50例（100%），表现为表皮全层细胞均为iNOS阳性表达；对照组20例正常皮肤中iNOS阳性14例（70%），iNOS阳性表达主要位于表皮基底层，且呈弱阳性表达，CA患者皮损中iNOS灰度值为（97.985±20.320）高于对照组（73.017±15.633）（P＜0.05）。50例CA 患者中 42例 HIF-1α 阳性（84%），高于对照组阳性 9例（45%）（P＜0.05）；且 HIF-1α在 CA 患者中灰度值为（0.204±0.064），高于对照组（0.135±0.019）（P＜0.05）。CA患者组织中iNOS与CD34表达呈正相关（r=0.375，P=0.007）；CA患者组织中HIF-1α与CD34表达呈正相关（r=0.393，P=0.005）。结论iNOS与HIF-1α可能协同参与CA的发病和发展。

尖锐湿疣；诱导型一氧化氮合酶（iNOS）；缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）

尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）是由人类乳头瘤病毒（HPV）感染所致生殖器增生性损害（亚临床感染除外），在临床呈逐年增多的趋势[1]，且极易复发，组织学中常可见上皮细胞及血管异常增生。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide，i-NOS）与组织增殖、血管增生有关[2]，缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α）是细胞对缺氧环境应答的重要的转录调节因子，其表达认为与组织增生有关[3-4]。本文旨在研究CA组织中i-NOS与HIF-1α的表达及其与CA发病与发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2015年1月-2016年8月贵阳中医学院第一附属医院收治的门诊患者50例，经临床及醋酸白实验诊断为CA患者，并经病理活检证实。其中，男性28例，女性22例；年龄19～63岁，平均37岁；病程10 d～1年。正常包皮对照组20例，来自同期我院泌尿外科包皮环切术者。年龄6～18岁，平均10岁。所有患者及对照组皮损组织放入10%中性福尔马林液固定过夜，常规石蜡包埋，4μm切片覆于多聚赖氨酸处理过的玻片上备用。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 iNOS一抗（购自Labvison公司），HIF-1α一抗和CD34试剂盒（购自武汉博士德生物有限公司）。

1.2.2 免疫组织化学法检测组织中iNOS、HIF-1α和CD34表达 采用Envision两步法进行检测：水浴锅中40 min进行抗原修复，3%链霉菌抗生素-过氧化物酶孵育20 min后，滴加iNOS、HIF-1α和CD34一抗，37℃孵育30 min，加以Envision/HRP室温孵育30 min，DAB显色。苏木素复染，常规封片。

1.2.3 判断标准 iNOS阳性为细胞膜或胞浆染色呈棕黄色或棕褐色；HIF-1α阳性为细胞浆和（或）细胞核内棕黄色染色。在200视野选择5个有代表性区域，每个区域计算200个细胞。阳性细胞评分：0～5%计 0分，6%～35%计 1分，36%～70%为 2分，＞70%为3分。染色程度：0为不着色，1为弱着色（淡棕黄色），2为强着色（明显棕黄色）。两项评分相加，≤2分为阴性，3分为（+），4分为（++），5分为（+++）。随机取5个视野，免疫组化评分为定量评分与染色程度评分之和除以2，得分为3～4认为是强阳性。阳性片使用Image-Pro Plus医学彩色图像分析系统进行半定量测定。

1.2.4 微血管密度计数（microvessel density，MVD）胞核或胞浆出现淡至棕黄或棕褐色颗粒为CD34阳性细胞，低倍镜下选择血管分布最高区域，高倍镜下计数着色的毛细血管和微小血管，取5个高倍视野血管数目平均即为MVD值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验；组间阳性率比较用χ2检验，相关分析采用Pearson直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 iNOS在CA及正常组织中的表达

50例CA患者中，iNOS阳性50例（100%），表现为表皮全层细胞均为iNOS阳性表达；对照组20例正常皮肤中iNOS阳性14例（70%），iNOS阳性表达主要位于表皮基底层，且呈弱阳性表达，CA患者皮损中iNOS灰度值为（97.985±20.320），对照组为（73.017±15.633），两组比较差异有统计学意义（t=5.528，P=0.000）。见附表和图 1。

附表 两组iNOS、HIF-1α与CD34表达比较 （±s）

附表 两组iNOS、HIF-1α与CD34表达比较 （±s）

组别 例数 iNOS HIF-1α CD34 CA 组 50 73.017±15.633 0.204±0.064 9.7120±2.145对照组 20 97.985±20.320 0.135±0.019 3.845±1.694 t值 5.528 6.889 10.928 P值 0.000 0.000 0.000

图1 iNOS在包皮组织中的表达

2.2 HIF-1α和在CA及正常组织中的表达

50例CA患者中42例HIF-1α阳性（84%），20例对照组中HIF-1α阳性9例（45%），两组间差异有统计学意义（t=10.988，P=0.001）；且 HIF-1α 在CA患者中灰度值为（0.204±0.064），在对照组中为（0.135±0.019），两组比较差异有统计学意义（t=6.889，P=0.000）。见附表和图 2。

2.3 CA患者iNOS和HIF-1α与CD34表达相关性

经Person直线相关分析结果显示，CA患者包皮组织中iNOS与CD34表达呈正相关（r=0.375，P=0.007）；CA患者包皮组织中HIF-1α与CD34表达呈正相关（r=0.393，P=0.005）。见图 3、4。

图中数据分布趋势呈正相关，且呈线性上升趋势，说明iNOS和HIF-1α有直线相关关系。

图2 HIF-1α在包皮组织中的表达

图3 CA患者包皮组织中iNOS和HIF-1α与CD34表达相关性

图4 CD34在包皮组织中的表达

3 讨论

CA[4]由人乳头瘤病毒感染所致，常发生在肛周及生殖器部位，主要表现为菜花状、乳头状及蕈样状疣状良性增生物，传染性强、生长迅速和易复发为其主要特征。占我国性传播疾病第2位，且仍有不断上升趋势，严重影响患者的生活、工作及心理，故而进一步研究该疾病的发生、发展机制，为疾病的治疗提供新的思路及途径具有一定的临床研究价值。典型的CA组织病理常可见上皮细胞及血管异常增生，基于组织病理上细胞及血管异常增生的特性，iNOS、HIF-1α与CA的相关性研究进入人们的视野。

CA虽为良性肿瘤，但其生长迅速，角质形成细胞增生明显，血运丰富，在细胞快速增长的过程中导致氧的需求量增加，造成局部缺氧微环境。一氧化氮（NO）[5]是机体内一种重要的信使分子，同时也是一种重要的效应分子，其具有扩张血管、增加血管通透性和促进血管生成的作用，由L-精氨酸经一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成。NOS有3种同工酶，即诱导型NOS（iNOS）、神经性NOS（nNOS）、内皮型 NOS（eNOS）。正常情况下，组织中iNOS表达量很少，只有炎症反应、免疫反应及肿瘤等病理情况下iNOS的表达增多，且其诱生NO的能力高于其余两型。大量研究表明[6]，iNOS与肿瘤血管生成之间存在相关性。有研究[7-8]表明，其可能机制为iNOS诱导NO生成，进而通过NO扩张血管、增加血管通透性、上调MMPs并下调TIMPs从而促进血管生成。其次，NO可通过刺激血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达，从而促进血管生成[9]。除此之外，研究证实[10]，iNOS还与细胞增殖密切相关。

HIF-1[11]是机体缺氧微环境下诱导基因表达和恢复细胞内环境稳定的1个核心调节因子，由1个α及1个β亚单位组成。HIF-1α在机体中受氧浓度调节，常氧条件下易被降解，而缺氧条件下，降解受阻，稳定增加，是HIF-1中真正起调节作用的功能单位。研究表明[12]，缺氧环境下，HIF-1α表达和合成增加，并通过与其靶基因中的缺氧反应原件-葡萄糖转运蛋白 1（glucose transporter 1，GLUT-1）结合，诱导GLUT-1大量表达，继而增加葡萄糖代谢，本研究结果显示，CA患者中iNOS及HIF-1α阳性强度高于对照组，且iNOS、HIF-1α表达与CD34表达呈正相关。该因素在CA患者中可能具有改善CA细胞快速增殖所致的能量失衡，进而助长CA的快速增长的作用。此外，研究发现[13-15]，缺氧反应基因VEGF、环氧合酶-2及iNOS上均有HIF-1α的结合位点，促进3者在缺氧环境下的表达，从而促进新血管生成，增加氧运输，改善缺氧微环境。

故而认为CA患者中iNOS及HIF-1α可能通过以上途径参与CA的发病与发展，且两者具有协同作用。

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Effect of iNOS and HIF-1α on condyloma acuminatum

Ran Wu1,Min Jia1,Ting Tang1,Zun-feng Ma1,Ai-juan He1,Lin-bo Sun1,Wen-tao Hu1,Yi-yan Zeng1,Hao Feng2
(1.Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou 550001,China;2.Department of Dermatology,Hunan Provincial People's Hospital,Changsha,Hunan 410005,China)

ObjectiveTo investigate the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)and hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)and their effect on development of condyloma acuminatum (CA).MethodsA total of 50 patients with CA and 20 healthy volunteers were collected.The expression of iNOS,HIF-1α and CD34 was determined by Immunohistochemistry.ResultsA total of 50 cases with CA were identified as iNOS positive(100%)which were expressed in whole epidermis;14 out of 20 volunteers(70%)were iNOS positive(weak signal)which were mainly expressed in epidermal basal cells.Gray value of iNOS in CA patients was higher than that in healthy volunteers(97.9854±20.3196 vs 73.0174±15.6330,respectively)(P＜0.05).Fortytwo out of 50 patients (84%)experienced increased expression of HIF-1α while only 9 volunteers had positive signals (45%) (P＜0.05).Gray value of HIF-1α in CA patients was higher than that in the control group (0.2035±0.0637 vs 0.1349±0.0194) (P＜0.05).Intimate correlation between iNOS or HIF-1α and CD34 in CA was observed (r=0.375 and 0.393,P＜0.05).ConclusioniNOS and HIF-1α is involved in the pathogenesis of CA.

condyloma acuminatum;inducible nitric oxide synthase;hypoxia inducing factor-1α

R752

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.010

1005-8982（2017）24-0049-04

2017-03-31

冯浩，E-mail：doctorfenghao@126.com

（王荣兵 编辑）