食管癌患者miR-182表达水平及其对预后的影响

鲁之中 ，李军民 ，胡云芝 ，李晓辉 ，李卫 ，姜富国 ，李帅 ，申辰

（河南省焦作市人民医院 1.检验科，2.儿科，3.肿瘤外科，河南 焦作 454002）

食管癌患者miR-182表达水平及其对预后的影响

鲁之中1，李军民1，胡云芝2，李晓辉3，李卫1，姜富国1，李帅1，申辰1

（河南省焦作市人民医院 1.检验科，2.儿科，3.肿瘤外科，河南 焦作 454002）

目的探讨miR-182在食管癌患者组织中的基因表达及其对预后的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测59例食管癌标本和癌旁组织中miR-182表达水平；并分析其表达水平与患者的临床病理特征和随访结局之间的关系。结果相较于癌旁组织，食管癌组织中miR-182表达水平增高（P＜0.05）；miR-182表达水平与肿瘤分化程度、浸润深度、是否发生转移以及临床分期相关（P＜0.05），与性别、年龄以及肿瘤大小无关系（P＞0.05）；生存分析显示miR-182高表达组总体生存期低于低表达组（P＜0.05）；Cox多因素回归分析结果显示miR-182表达水平可作为食管癌患者预后不良的标志之一。结论miR-182在食管癌组织中高表达，其高表达提示预后较差，可作为食管癌潜在的预测分子标志物。

miR-182；食管癌；预后；实时荧光定量PCR

食管癌在我国属于临床常见恶性肿瘤之一，病死率高，危害较大，其病理类型＞90%为鳞癌。虽然根治性食管癌切除术+化疗的治疗方案已经普及，但其5年总体生存率仍较低[1]。到目前为止，虽然分子生物学研究已发现食管癌发生过程中大量异常出现的分子事件，但是针对食管癌高危人群筛选、早期诊断以及预后判断的有效分子标志物仍很有限。因此，更深入的研究和筛选食管癌早期诊断和预后判断分子标志物具有重要临床意义。

MicroRNAs是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，主要通过与靶mRNA结合抑制其蛋白表达从而实现其生物学功能[2]。研究发现，miRNAs在多种肿瘤，包括食管癌的发生、发展过程中发挥重要作用，因此其异常表达可能作为食管癌潜在的诊断和预后判断的标志物。

近期研究发现，MicroRNA 182（miR-182）在多种肿瘤中异常表达，并且其异常表达跟患者预后相关。JIAN等[3]发现食管癌细胞系KYSE410中miR-182上调，且食管癌患者血清中miR-182同样高于正常对照，但食管癌组织中miR-182表达情况以及异常表达的miR-182跟食管癌患者预后是否相关尚不明确。本研究主要通过实时荧光定量PCR检测miR-182在食管癌标本中的表达水平，并结合临床病理及随访资料，探讨miR-182在食管癌预后判断中的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 标本来源 选取2011年2月-2013年2月本院手术切除并且常规HE染色确定为食管鳞癌患者的食管癌组织和相应癌旁正常组织，所有标本均液氮冻存并存储于-80℃冰箱中，后续用于提RNA。所有患者术前均未接受化疗并且均签署知情同意书。食管癌病理分型及分期标准按照国际抗癌联盟（international union against cancer，UICC）食管癌分期标准执行。本研究经焦作市人民医院医学伦理委员会批准。

1.1.2 患者资料 食管癌患者总共59例。其中，男性38例，女性21例；年龄44～79岁，中位年龄61岁；临床分期Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ、Ⅳ期23例；中、高分化29例，低、未分化30例。

1.1.3 主要试剂及仪器 高速冷冻离心机（购自德国eppendorf公司）、nanodrop紫外分光光度计（购自美国nanoDrop公司）、PCR反应仪（美国Bio Raid公司）、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（购自美国ABI公司）、miRcute miRNA isolation kit（购自北京天根公司）、miRNA逆转录及荧光定量试剂盒（购自日本TaKaRa公司）、has-miR-182及内参RNU6B引物（购自美国金维智公司）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 根据天根miRcute miRNA isolation kit试剂盒操作步骤，取0.1 g组织液氮保护下研磨，加入1 ml裂解液，加入氯仿抽提，并用过柱法分别提取肿瘤组织和癌旁组织总RNA。用紫外分光光度计测量RNA浓度及吸光度，要求A260/A280＞1.8。取1μl RNA溶液在1.5%的变性琼脂糖凝胶中进行电泳，测定RNA的完整性。

1.2.2 加尾法逆转录 取1μg总RNA使用Prime-Script miRNA cDNA合成试剂盒进行cDNA的合成，反应体系为20μl，具体操作步骤见使用说明书。

1.2.3 miR-182表达水平检测 用以上步骤获得的cDNA进行适当稀释，参照SYBR Premix Ex Taq kit试剂盒说明书进行操作。反应具体过程为：50℃激活聚合酶2 min，95℃预变性1 min；95℃变性5 s，60℃退火和延伸34 s，扩增40个循环；结束后制作溶解曲线。采用管家基因U6作为内参对照。

1.2.4 qRT-PCR结果分析 结果采用2-ΔΔCt法进行处理，首先获取miR-182和内参U6的Ct值，然后计算ΔCt=Ct（miR-182）-Ct（U6），再计算ΔΔCt=ΔCt肿瘤组织-ΔCt癌旁组织，进一步计算 miR-182在食管癌组织和癌旁组织中的表达倍数的差异。

1.3 随访

所有食管癌术后患者均进行电话随访，了解术后并发症、复发以及生存情况等信息，随访截止日期为2016年5月，中位随访时间为29个月（5～42个月）。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间miRNA-182表达倍数的均值差异采用配对样本t检验分析；miRNA-182与临床病理特征的关系用χ2检验；采用Kaplan-Meier法进行生存分析，并绘制生存曲线；采用Cox回归模型进行多因素分析，其中α入=0.05，α出=0.10；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-182在食管癌组织和癌旁组织中的表达

结果显示，食管癌肿瘤组织中miR-182表达水平（10.89±3.95）高于癌旁组织（6.34±2.91，P=0.000）。见图 1。

2.2 miR-182的表达水平与食管癌患者临床病理特征之间的关系

根据miR-182的表达情况，将食管癌患者分为miR-182高表达（n=30）和低表达组（n=29）。食管癌组织中miR-182的表达水平与患者临床病理特征间的关系见表1。miR-182的高表达跟食管癌患者肿瘤分化程度（P=0.042）、T分期（P=0.007）、淋巴结转移情况（P=0.001）以及临床分期相关（P=0.001）；而跟患者性别（P=0.336）、年龄（P=0.436）以及肿瘤大小无关（P=0.110）。见表1。

图1 miR-182在食管癌组织和癌旁组织中的相对表达量（n=59）

图2 不同miR-182表达水平食管癌患者的生存分析

2.3 miR-182表达水平与食管癌患者预后的关系

miR-182高表达组中位生存时间（平均28.9个月）低于miR-182低表达组（36.1个月），差异有统计学意义（P=0.015）（见图 2）。此外，Cox比例风险模型多因素分析结果显示，T分期（P=0.060），临床分期（P=0.687）以及分化程度（P=0.140）跟食管癌患者预后无关；淋巴结转移（P=0.027）以及miR-182表达水平（P=0.032）是食管癌患者预后的独立危险因素。见表2。

表1 食管癌组织中miR-182表达水平与患者临床病理参数之间的关系

表2 食管癌患者总生存期Cox多因素回归分析相关参数

3 讨论

食管癌是临床常见的恶性肿瘤之一，病死率较高，且预后较差。目前很多临床病理学特征可作为食管癌患者预后的重要提示，但是其不能准确且个体化预测患者预后情况[4]。因此，研究食管癌发生、发展过程中关键分子生物学事件，寻找能早期诊断、靶向治疗以及预后预测的重要分子标记物具有重要临床意义。

现已在哺乳动物中发现超过1 900条miRNAs，该miRNAs可调控超过60%基因功能[2]。在肿瘤研究中已证实异常表达的miRNAs可发挥促癌或者抑癌的作用；且该异常表达的miRNAs也可作为潜在的诊断和预后判断的标志物[5]。近年来，食管癌中的研究发现越来越多异常表达的miRNAs；其中miR-21[6]、miR-192[7]和miR-106b等[8]上调，可促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移；miR-375[9]、miR-203 等[10]下调，可抑制肿瘤细胞周期并且促进其凋亡。此外，miR-21[11]和miR-375[12]在食管癌预后判断中的研究也已经被证实。本研究主要就miR-182在食管癌中的表达以及其临床意义就行探讨。

本研究结果显示，相较于癌旁组织，miR-182在食管癌组织中表达上调。JIANG等[3]发现，食管癌细胞系KYSE410中miR-182上调，并且食管癌患者血清中miR-182同样高于正常对照。以上结果提示miR-182在食管癌中具有癌基因的倾向。但是，目前研究发现，miR-182在不同肿瘤中发挥不同的作用。在宫颈癌[13]、乳腺癌[14]以及肝癌[15]中，miR-182 可促进肿瘤进展；但是在胃腺癌[16]和肺癌[17]中，miR-182可抑制肿瘤的进展。由于miRNA的作用机制是通过和目的mRNA结合抑制其功能，其产生的总体生物学效应依赖于其调控的不同基因之和，因此，同一miRNA在不同肿瘤中能发挥不同的生物学效应。此外，检测手段的差异以及肿瘤患者的异质性也是miRNA不同生物学效应产生原因。

此外，笔者发现miR-182的高表达跟食管癌分化程度、浸润深度、是否淋巴结转移以及临床分期密切相关，生存分析结果显示高表达miR-182患者预后较低表达患者差，且单因素和多因素回归分析结果也证实miR-182的表达水平跟食管癌患者预后相关，以上结果提示miR-182在肿瘤的侵袭转移相关，且具有一定的病情评估和预后判断作用。JANG等[18]发现miR-182在黑色素瘤肿瘤组织表达上调，且其表达水平跟病理分级以及预后密切相关。LIU等[19]发现结肠癌中高表达的miR-182跟肿瘤大小和肿瘤转移密切相关，并可以作为预后判断的有效指标。

本研究主要从临床角度去研究miR-182异常高表达与食管癌临床特征的相关性，未进一步从分子角度探讨其促进食管癌发生、发展的机制。在多种肿瘤中，miR-182的促癌机制均有过报道。miR-182在成神经管细胞瘤中可通过活化PI3K/Akt/mTOR通路促进肿瘤细胞的增殖[20]。在乳腺癌中，miR-182可抑制多种抑癌基因的表达，如BRCA1、FOXO1和FOXO3等[21-23]。而在葡萄膜黑色素瘤细胞中，miR-182主要通过靶向调节MITF、BCL2或细胞周期蛋白D2起到抑癌基因的作用[24]。miR-182在食管癌中的研究不多，JIANG等发现miR-182可通过抑制MTSS1促进食管癌细胞的增殖和侵袭转移[25]。miR-183和miR-182属于同一家族，可能具有相似的生物学功能，研究也发现miR-183可通过调节食管癌细胞中PDCD4抑制其凋亡[26]。

综上所述，miR-182在食管癌中的表达水平具有重要的临床意义，其在肿瘤的发展过程中可能发挥癌基因的作用，并且可以作为一个潜在的独立预测预后的因素。

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Expression of miRNA-182 and its effect on prognosis of esophageal carcinoma

Zhi-zhong Lu1,Jun-min Li1,Yun-zhi Hu2,Xiao-hui Li3,Wei Li1,Fu-guo Jiang1,Shuai Li1,Chen Shen1
(1.Department of Laboratory,2.Department of Pediatrics,3.Department of Surgical Oncology,People's Hospital of Jiaozuo,Jiaozuo Henan 454002,China)

ObjectiveTo investigate the concentration of miRNA-182 in esophageal carcinoma and its association with disease prognosis.MethodsMicroRNA-182 in 59 esophageal carcinoma tissues and related adjacent healthy tissues were measured by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCT).Association of miRNA-182 with clinical characters including pathologic types,and clinical outcome was determined.ResultsThe concentration of miRNA-182 in esophageal carcinoma tissues was significantly increased when compared with that in adjacent healthy tissues (P＜0.05).Overexpression of miRNA-182 correlated closely with tumor differentiation level,depth of infiltration,metastasis,and clinical stage(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis indicated that patients with high miRNA-182 experienced worse outcome compared with others(P＜0.05).Moreover,multivariate analysis showed that increase of miRNA-182 was an independent predictor of overall survival(P＜0.05).ConclusionsMicroRNA-182 is overexpressed in esophageal carcinoma tissue and concentration of miRNA-182 is closely correlated with poor outcome,suggesting that miRNA-182 may serve as a prognostic biomarker for esophageal carcinoma.

miRNA-182;esophageal carcinoma;prognosis factor;qRT-PCR

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.008

1005-8982（2017）24-0039-05

2017-03-30

（王荣兵 编辑）