莲基因组学和分子生物学研究进展

刘正位+季群+柯卫东+朱红莲+刘玉平+彭静+匡晶+王芸+郭丹丹

摘 要：综述了莲藕基因组学和分子生物学研究进展，主要包括莲核基因组和细胞器基因组测序、系统进化和遗传多样性、重要基因挖掘和功能分析等，并对其今后的研究进行了展望。

关键词：莲；基因组学；分子生物学；研究进展

中图分类号：S645.1 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）18-0041-08

莲属于莲科莲属，是一种古老的双子叶植物，其最早的化石可追溯至早白垩纪晚期，距今100.5百万～113.0百万a前[1]，它与水杉银杏等冰川孑遗植物一样，是当今地球上幸存的活化石植物[2]，在新石器时代早期即被当时的人类大量采集食用，

7 000 a前即被作为食物进行种植，具有悠久的栽培和驯化历史。莲是集食用、观赏、药用、环保等重要作用为一身的重要水生蔬菜。莲属中国十大名花，其地下茎和莲籽均富含淀粉，可供食用。莲籽可鲜食也可加工成通心白莲、莲籽汁、莲籽粉、莲蓉等，其节、叶、花、蒂、须等都可入药。此外，荷叶的自洁功能[3，4]和千年古莲籽开花之谜[5～7]也吸引着越来越多研究者的兴趣。中国莲栽培主要分布在长江流域、珠江流域和黄河流域，其中以长江中下游种植面积最大，台湾省也有一定面积的莲藕种植。据《中国农业统计资料》（2009年）统计，全国22个省、市（自治区）的莲藕播种面积

25.29万hm2，产量749.9万t。全国子莲的主产区分布在江西省、福建省、湖南省、湖北省、浙江省等地。日本、印度、越南等东南亚国家也有栽培，每年子莲种植总面积5.3万～6.7万hm2。

近年来，莲基因组学和分子生物学发展迅猛，相关研究也愈加广泛和深入。本文综述了莲基因组学和分子生物学研究进展，并讨论了未来可能的研究领域和方向，以供参考。

1 基因组测序和遗传图谱构建

1.1 莲核基因组测序

2013年，中国科学院武汉植物园和美国伊利诺伊大学[8]联合完成了中国古代莲的全基因组测序，组装基因组大小804 Mb，占莲藕基因组的86.5%；基因组中含有57%的重复序列，转座因子占47.7%，对26 685个基因进行了注释，基因的平均长度为6 561 bp。22 803个基因在地下茎、根、叶片或心皮中表达，占基因总数85.5%，其中，持家基因14 477个，组织特异性表达基因3 094个。发现了莲藕在进化过程中存在瓶颈效应和全基因组复制现象，也从基因层面上对莲藕水生生长环境适应性进行了探讨。同年，武汉市蔬菜科学研究所和深圳华大基因[9]合作完成了中间湖野莲的全基因组测序。组装基因组大小为792 Mb，GC含量为38.7%，编码基因40 348个，平均基因长度为

3 431 bp，平均外显子3.68个，外显子和内含子平均长度分别为246、939 bp。发现膜联蛋白基因ANNfam5中存在2个明显的正向选择位点，可能是莲籽保持长久生命活力的原因所在。对莲中淀粉合成相关基因的深入分析表明，其GBSS基因有明显的扩张现象，可能是莲籽及其地下茎中淀粉合成的关键基因。

1.2 莲细胞器基因组测序

2014年，武汉大学[10]对中国莲和美洲黄莲的叶绿体基因组进行了测序，中国莲和美洲黄莲叶绿体基因组全长分别为163 307、163 206 bp，GC含量各占碱基的37.99%和38.01%，编码113个基因。根据叶绿体基因组序列对莲属的系统进化地位进行分析表明，莲科应归类到双子叶植物中的山龙眼目（分类名称）中，约有110百万a的进化历史，中国莲和美洲黄莲的分离时间约在2.41百万a前。

2016年，武汉大学[11]使用单分子实时测序技术（SMRT）测定了莲的线粒体基因组，并在从头组装和注释之后构建了线粒体基因组图谱。结果表明，524 797 bp的莲线粒体基因组共有63个基因，揭示了莲线粒体基因组具有进化上的保守性特征，即保留着古老的基因簇和基因数目、高频率的RNA编辑以及低频率的叶绿体片段的插入等现象。

1.3 遗传图谱构建

遗传图谱构建在基因定位和图位克隆中具有重要地位。Yang等[12]利用中国古代莲×美洲黄莲的50株F1代分离群体，利用基因組测序获得的SSR标记和SRAP标记分别构建了第一张中国古代莲和美洲黄莲遗传图谱，美洲黄莲的遗传图谱含11个连锁群，177个标记，全长524.51 cM；其亚洲莲的遗传图谱含7个连锁群，47个标记，全长365.67 cM。随后，Zhang等[13]利用SNP标记将该图谱进一步完善，构建了包含9个连锁群，总长543.4 Mb，由562个序列标签集和156个SSR标记构成的高密度遗传图谱。武汉市蔬菜科学研究所[14]利用鄂子莲1号和鄂莲9号为亲本构建的F2遗传群体结合简化基因组测序技术，构建了一个相对完整的由8个连锁群构成的遗传图谱，该遗传图谱全长556 cM，含891个共整合标记，平均遗传图距为0.74 cM。

近20 a来，随着分子生物学和基因组学等新兴学科的兴起，特别是最近几年，第二代高通量测序技术乃至第三代测序技术的迅速发展，为莲藕基因组学研究插上了腾飞的翅膀。目前，利用基因组测序技术进行莲藕遗传多样性研究、大规模分子标记开发和高密度遗传图谱构建乃至基因定位等成为目前莲藕基因组学研究的热点，必将促进莲藕分子育种的跨越式发展。

2 莲系统进化和遗传多样性

2.1 莲系统进化研究

莲与睡莲科植物具有相似的叶、花器官以及生长环境，在1973年，林奈对莲进行了描述并将其隶属于睡莲科（Nymphaeaceae）睡莲属（Nymphaea nelumbo Linn.），这一观点为之后200 a内的许多植物学家所接受。然而，莲属与睡莲科其他属在形态、染色体、花粉结构等方面存有显著的差异：如莲属具有不同于睡莲属的独特倒圆锥形的花托和离生的雌蕊[15]；莲属无胚乳，而其他睡莲科植物含有丰富的外胚乳和胚乳[16]；莲染色体基数为8，而睡莲其他属一般为12或17，且染色体形态不同于睡莲其他属[17]；莲属花粉为三沟花粉，花粉覆盖层为网状，花粉外壁具有明显的柱状层结构，与睡莲科其他属的花粉类型不同[18]。此外，花粉萌发孔形成时期、萌发孔数目和位置等也不同于睡莲科其他属。这些证据均表明，莲属和睡莲科其他属在分类学上具有显著差异，应把莲属从睡莲科提出并独立成莲科（Nelumbonaceae）。endprint

随着分子生物学技术的发展，利用基因序列对植物进化系统研究逐渐占据主导地位，特别是利用叶绿体基因組中高度保守的如ChrbcL，atpB，18S，matK，26S等基因进行系统进化研究。1993年，Chase等[19]测定了包括莲在内的数百个物种的叶绿体rbcL基因序列，莲被定为一种位于双子叶植物基部的分支双子叶植物。2000年，Soltis等[20]结合atpB和rbcL 2个基因对包括莲在内的被子植物进行了系统进化分析等，再用独立或多个基因联合分析结果均表明，莲科不属于睡莲目，而和分支双子叶植物比较接近。2014年，Wu等[10]利用叶绿体基因组测序获得的78个叶绿体蛋白质编码基因，对包括莲在内的80个不同物种进行了系统进化分析，结果也表明莲科属于分支双子叶植物，归属于山龙眼目，迄今有110百万a的进化历史。利用莲核基因组序列进行净化分析的结果与叶绿体分析结果相似，即同样证实了莲属于位于双子叶植物基部的最古老的双子叶植物之一[8]。

2.2 莲分布及遗传多样性研究

莲属植物现仅存2个种，莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）和美洲黄莲（Nelumbo lutea Willd.），在东半球分布的是莲，在西半球分布的是美洲黄莲[21]。在亚洲地区，莲广泛分布，因此莲又被称为亚洲莲，野莲主要分布在我国东北地区、长江中下游流域、云贵高原和东南亚各国。栽培莲在我国有着悠久的历史，其主要分布区域与野莲基本相同。在长期的栽培过程中，已驯化出藕莲、子莲、花莲3种不同的栽培类型。在采用分子标记研究莲的遗传多样性方面，2004年武汉市蔬菜科学研究所率先采用RAPD标记开展了莲资源遗传多样性研究[22]，武汉大学、中国科学院武汉植物园和日本京都府立大学等单位也相继采用其他分子标记技术对莲遗传多样性进行了研究，至今已有随机扩增片段多态性标记（RAPD）[22～24]、内部简单重复序列（ISSR）[24，25]、简单重复序列（SSR）[26～31]、扩增片段长度多态性（AFLP）[31，32]和相关序列扩增多态性（SRAP）[30]等标记在莲藕的遗传多样性研究中得到了应用。研究范围主要为亚洲莲和美洲莲亲缘关系、亚洲莲不同生态型划分、中国不同地域野莲及居群多样性及中国主要栽培莲如藕莲、子莲和花莲分类等方面。

对亚洲莲和美洲黄莲遗传关系的研究结果均表明[24，29，30，32]，美洲黄莲与中国莲遗传距离较远，两者在DNA水平上具有明显的差异，美洲黄莲和亚洲莲应为2个独立类群，这是由长期地理隔绝和进化导致的。研究表明，中国东北及长江流域野莲资源遗传多样性相对较为低下，云南地区莲资源多样性似乎更为丰富。如薛建华等[33]采用ISSR和RAPD标记对黑龙江地区野莲的研究表明，野莲遗传多样性不高，黑龙江5个不同野生居群间遗传相似性高达0.931 4～0.995 4，其多样性显著低于栽培莲资源。Han等[34]对我国中部地区不同湖泊野莲遗传多样性进行了分析，结果表明，其野莲居群在物种水平上具有较高的多态性，而群体间遗传分化较大。千瓣莲作为云南地区特有的莲资源，在我国作为花莲广泛栽培。郭宏波等[35]采用RAPD标记对5份来自云南地区的千瓣莲资源进行了分析，表明中国千瓣莲资源具有丰富的遗传多样性。美洲黄莲多样性少有报道，Li等[36]对来自美国不同地方的7个野生美洲黄莲居群进行遗传多样性研究，美洲黄莲居群间遗传多样性较高（FST=0.81），而群体内遗传多样性非常有限。

在亚洲莲生态型划分方面，张行言等[37]将花莲资源分为热带型和温带型2种类型。Yang 等[38]采用SSR标记的研究表明，泰国和中国东北野莲居群在遗传上具有的明显差异，为这种分类提供了分子依据，并认为中国东北野莲属温带型，而泰国野莲属热带型。柯卫东等[39]发现，东北地区野莲资源在武汉生长植株矮小，根状茎膨大极早，与长江中下游地区野莲不同，应属不同生态型的莲藕，认为莲应按纬度分布划分为温带型、亚热带型和热带型三种不同生态型。Li等[40]从叶绿体序列变异角度证实了中国东北的野莲单倍型和我国中部南部地区的野莲单倍型具有显著的差异。因此，综合上述研究将莲分为温带型、亚热带型和热带型3个生态型是比较合理的。

在栽培莲类型划分方面，采用RAPD[22]、SSR[30]和AFLP[32]等不同标记或不同来源样品的研究结论基本类似，即栽培莲可划分为子莲、藕莲和花莲3个类群，具有较明显的遗传分化，这与传统上按形态和栽培类型分类相一致。如郭宏波等[22]采用RAPD标记将莲属种质资源划分为3个品种群：藕莲、子莲和花莲，并推测藕莲、子莲和花莲可能由不同遗传背景的野莲演化而来。瞿桢等[41]研究表明，藕莲、子莲和花莲三大类群有明显的界限，藕莲和子莲的遗传距离较远，而花莲和子莲遗传距离较近，研究还表明，中国莲3种类型中，花莲遗传多样性最高，藕莲的多样性最低。Hu 等[31]采用AFLP和SSR标记将栽培莲明显地划分为藕莲和子莲两大类群，而花莲则分别在子莲和藕莲类群中并独立成支，同样表明藕莲、子莲和花莲存在明显的差异。Fu等[32]的研究认为，子莲和花莲常常混合聚在一类，两者间并无明显的界限，子莲和花莲之间的亲缘关系较近。

3 莲重要基因的挖掘和相关研究

3.1 与淀粉合成相关酶基因的挖掘和分析

淀粉是莲藕主要营养成分，调控莲藕淀粉合成的相关酶类主要有ADPG-焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脱分支酶等。陆叶等[42]从莲藕美人红中扩增得到淀粉颗粒结合合成酶基因，基因全长2 265 bp，开放阅读框1 848 bp，编码615个氨基酸，序列分析表明，莲藕GBSS基因与金鱼草、马铃薯、大豆和水稻中同源基因的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%和50.6%；其氨基酸序列与金鱼草同源性最高，达到77%，与马铃薯、甘薯的同源性达到75%，与豆科植物的同源性在70%～75%，与禾本科植物的同源性在65%～70%。张莉等[43]克隆得到可溶性淀粉合成酶基因（LrSSS）cDNA序列，基因全长4 080 bp，开放阅读框3 696 bp，编码1 231个氨基酸；该序列与甜瓜、葡萄SSS基因编码氨基酸序列同源性较高，分别达79%、69%。程立宝等[44]利用转录组测序技术，归纳并分析86个可能与莲藕根状茎膨大相关基因，分别为35个激素诱导蛋白基因、4个光诱导蛋白（MADS-BOX）基因、11个根状茎贮藏蛋白基因（Patatin）、35个与淀粉代谢相关基因以及1个与根状茎形成相关基因。程立宝等[45]进一步研究发现，有34个基因参加了莲根状茎淀粉合成过程，其中LrGBSS、LrSBEI、LrSBEII和 LrSBEIII 4个基因在地下茎膨大后期表达量显著增加。endprint

3.2 与抗病抗逆等相关的基因及基因家族的挖掘和分析

莲藕组织中含有大量的还原酶类，如多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（cytCuZnSOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等。西北农林大学张跃进等[46]从莲藕茎尖中克隆到了PPO基因全长序列，其cDNA长2 074 bp，开放阅读框1 503 bp，编码501个氨基酸，蛋白质分子量约为56.8 kD，具有典型的酪氨酸家族结构域。该基因在莲藕茎尖、幼叶、藕鲜切片、花瓣、茎秆5种组织中均有表达，其中茎尖和幼叶中表达量最高，莲藕、花瓣和茎秆表达量较少。武汉大学克隆了Mn-SOD[47]、cytCuZnSOD[48]和APX[49]等基因。Mn-SOD基因全长926 bp，包括699 bp的开放读码框，发现其在莲藕幼叶、花、茎、茎尖等多个组织中表达，且在幼叶中表达量最高[47]；cytCuZnSOD基因在叶柄和幼叶中表达量高于在根中的表达量[48]；而APX基因在莲幼叶、根、茎尖和叶柄中均有表达，且在受伤组织中能应激性表达[49]。Liu等[50]发现，莲中的植物螯合肽合成酶（Phytochelatin synthase，PCS）NnPCS1参加了对金属铬的胁迫反应，在进行铬胁迫处理后莲叶片中的NnPCS1基因表达量显著升高，在拟南芥中表达NnPCS1基因可显著提高对铬的吸收和积累。NBS（Nucleotide-binding site）类抗病基因是植物中最重要的一类抗病基因，其进化模式、结构特点和功能调控一直是抗病基因研究领域的热点。Jia等[51]从莲基因组序列中发现了137个NBS类抗病基因，分析表明，莲基因组中该类基因与全基因组序列一样存在着古老的复制和重组事件，且其中52个NBS基因中含有仅在动物、真菌和细菌基因组NBS基因中报道过的NACHT结构域，暗示着NACHT基因和NBS基因可能具有类似的古代起源，在水生至陆生植物抗病变迁中起着重要作用。GRAS基因家族是一类具有物种特异性的基因家族，参与了植物发育和生理过程。Wang等[52]从莲基因组中鉴定出了38个GRAS基因，对其种类、结构进行了研究，并与水稻、拟南芥等作物中的GRAS基因家族进行了比较分析。R2R3-MYB转录因子作为调节蛋白广泛参与苯丙烷类代谢途径的调控，主要為黄酮类代谢途径，与植物色素合成路径相关。Deng等[53]在莲基因组中发现了116个R2R3型 MYB基因，研究表明，13个候选基因与莲不同组织中类黄酮合成有关，其中2个基因分别在花和种子中正向调节花青素和原花青素的生物合成。Jin 等[54]发现莲中的海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphate synthase，TPS）基因家族在进化过程中受到纯化选择，且在淹水处理下TPS基因表达量均显著提高，发现其中2个TPS基因可能在莲能量代谢和胁迫反应中起着重要作用。此外，莲藕中的一些抗逆相关蛋白基因如金属硫蛋白基因NnMT2a[55]、膜联蛋白基因NnANN1[5]和转录因子LrbZIP[48]被成功克隆并转化到拟南芥或烟草中，提高了转基因植株抗逆性。

3.3 莲重要生理过程的转录组研究

在莲重要生理过程的转录组、蛋白质组和代谢组研究方面，Cheng等[56]对藕发育和膨大过程中的基因表达模式，转录组分析发现了20个在莲藕藕鞭期、膨大前期、中期和后期均差异性表达的基因，分析表明，这些基因主要和能量代谢和贮存相关。Deng等[57]利用蛋白质组结合表观遗传学研究表明，ANS基因启动子甲基化可能是调控莲开红花或白花的主要原因。Yang等[58]利用转录组分析了热带莲和温带莲地下茎发育的差异基因，发掘出与莲地下茎膨大过程相关的24个基因，这些基因主要与光周期、淀粉合成代谢及激素传导相关。Wang 等[59]利用代谢组结合蛋白组分析了莲籽发育的4个不同时期代谢物和蛋白的动态变化，研究表明，其糖代谢、糖酵解、三羧酸循环和氨基酸代谢等过程具有明显的差异，重构了莲籽发育过程中的合成代谢途径。Liu等[60]构建了莲高温胁迫下的转录表达谱，其中小分子热激蛋白（sHSPs）在热激后快速、大量富集，细胞及其组分形态建成相关基因如伸展蛋白、细胞壁结构基因、木葡聚糖相关基因和脂质转运基因等在热胁迫后被强烈诱导，研究表明蛋白质的折叠加工、细胞及其组分的形态建成与莲的热激胁迫密切相关。

3.4 莲miRNA研究进展

miRNA在生长发育过程中起着重要的调控作用。Zheng等[61]从叶片和花中鉴定出了分别属于41个保守和已知基因家族的81个miRNA，并预测了137个已知的miRNA靶标基因。Pan等[62]在莲基因组发现了属于40个家族的106个 miRNA，成熟的miRNAs长20～24个碱基，其前体长55～184个碱基，并对456个miRNA的靶标基因进行了注释，发现在莲叶片、茎和花等不同组织中，5个miRNA和靶标基因的表达量存在着明显的负相关关系。Shi等[63]通过对叶、茎、花瓣、柱头等不同莲组织的小RNA测序鉴定出了667个miRNA，发现具有高龄、高拷贝和目标数的miRNA家族往往具有较低的丢失频率倾向，并发现丢失频率与基因组复制之间有着密切联系，发现花粉-柱头互作相关的miRNA存在强烈的净化选择作用，热带莲和温带莲miRNA序列上的差异与其靶标基因在叶片和藕发育过程中的表达差异有关。

Jin等[64]对淹水处理的RNAi及其靶标基因调控网络进行了分析，发现了在淹水逆境条件下差异表达的128个已知和20个新的miRNA基因，并鉴定出了629个靶标转录产物并对其进行了注释，研究发现一些与代谢、生理和形态适应相关的miRNA在淹水适应中发挥了重要作用。Hu等[65]鉴定出了莲籽萌发过程中47个家族的145个已知的和78个新的miRNA，发现一些在单子叶和双子叶植物中均未曾报道过的miRNA，对其鉴定出的2 580个靶标基因分析表明，这些基因主要集中在转录调控、碳水化合物代谢、氨基酸和能量代谢等生理过程中。此外，还有对莲小干扰RNA及其位点（PHAS）的挖掘和研究等[66]。endprint

4 总结与展望

基因组测序包括叶绿体测序等大量的分子证据已基本证明了莲在植物进化史上的地位，即其属于双子叶植物基部，其与山龙眼科和悬铃木科较为接近，这目前在学术上已无争议。在美洲黄莲和亚洲莲起源和进化方面，分子生物学证据认为其具有共同的祖先，而化石证据表明亚洲莲和美洲黄莲分别起源于欧亚大陆和北美大陆的不同物种，因此，需要更为广泛的收集美洲黄莲资源才可能获得一个更为准确的评价，也有助于深入揭示莲不同种间的进化历史。

在亚洲莲分类方面已取得许多进展，基本明确了中国栽培莲类型划分、亲缘关系和遗传多样性等。现有研究表明，莲多样性较低，特别是野莲的多样性甚至低于栽培莲，这在其他作物如大豆、水稻等作物中是不常见的，其主要原因可能与中国历史气候变迁和历代对湖泊的围垦破坏，莲生境的急剧减少有关。长期以来，长江流域湖泊河流众多，莲分布广泛，类型多样，被认为是莲的起源中心之一。而我们的初步研究表明，我国云南地区以及泰国、新加坡等东南亚地区野莲资源多样性高于长江流域和东北地区。因此，我们推测东南亚和云贵高原地区更有可能是莲的起源中心，因此，进一步加强东南亚、云贵高原地区莲资源的收集和研究，明确亚洲莲的遗传多样性、起源和进化，将有利于莲资源保存和保护、新品种选育和特异基因挖掘等。

近年来，二代测序技术、蛋白质组、代谢组等技术的飞速发展极大地促进了莲分子生物学研究的发展。在此基础上，已有一批生长发育、抗病抗逆调控相关的基因被成功挖掘和分析，然而重要农艺性状相关的基因挖掘和相关研究仍较为少见。此外，由于莲组织培养和转基因技术研究的滞后，少有研究能将基因功能和表型验证相结合，也阻碍了莲基因功能的深入研究和应用。因此，我们提出：①应加强在育种上具有重要应用价值的莲功能基因的挖掘和研究，如抗病性、产量等，开展重点栽培莲主要农艺性状定位和标记开发工作，如藕莲性状入泥深度、煨汤品质、地下茎大小等和子莲性状如莲蓬数、心皮数和籽粒大小等，以助力于莲分子育种的发展。②组织培养和转基因技术在莲优异种质快速纯合、重要基因功能验证和外源基因导入等方面具有不可或缺的重要作用。应进一步加强莲组织培养和再生体系建立的相关研究，力争在相关方面有所突破。此外，在目前体细胞胚再生体系尚未建立和转基因研究仍是空白的情况下，能否尝试其他转基因方法和策略，如茎尖轉化法、花粉管通道法等，值得进一步探索。③莲具有广泛的药用、保健功能，其主要能效因子为其富含荷叶碱、多酚、黄酮等次生代谢产物，加强对莲次生代谢物含量、功能、合成代谢路径及其基因的研究，促进莲保健药用原理机制研究，对推动莲各类药物保健产品的研发，提高对莲传统废弃物如荷叶、莲房等的利用，扩充莲生产价值链，提高莲种植效益具有重要意义。

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Research Progress in Molecular Biology and Genomics of Nelumbo

LIU Zhengwei， JI Qun， KE Weidong， ZHU Honglian， LIU Yuping，

PENG Jing， KUANG Jing， WANG Yun， GUO Dandan

（ Vegetable Research Institute， Wuhan Academy of Agricultural Sciences， 430345 ）

Abstract： In this article， we reviewed the research progress in molecular biology and genomics of Nelumbo， including nuclear and organelle genome sequencing， phylogenetic evolution and geneticdiversity， gene mining and functional analysis， and the possible future research is also prospected.

Key words： Nelumbo； Genomics； Molecular biology； Research progressendprint