补肾调经方、逍遥丸对促性腺激素预处理小鼠排卵数目的影响*

(石家庄 050200)

河北中医学院中西医结合学院

实验研究

补肾调经方、逍遥丸对促性腺激素预处理小鼠排卵数目的影响*

段彦苍宋翠淼Δ杜惠兰(石家庄 050200)

河北中医学院中西医结合学院

目的：探讨补肾调经Ⅱ号方与Ⅲ号方高低剂量序贯使用、逍遥丸高低剂量序贯使用对促性腺激素预处理未成年小鼠排卵数目的影响。方法：17组未成年雌性小鼠腹腔注射血促性素(PMSG)、绒促性腺素(hCG)的基础上在实验第1～3 d灌服补肾调经Ⅱ号方或逍遥丸高低剂量(对照组灌服蒸馏水)，实验第4～5 d灌服Ⅲ号方或逍遥丸高低剂量(对照组灌服蒸馏水)。注射hCG后19 h在体式显微镜下将输卵管壶腹部刺破，释放出新鲜卵子，拍照后计数卵子数，对卵子数进行单因素方差分析、析因分析。结果：单因素方差分析：补肾组以补肾调经Ⅱ号方高剂量与补肾调经Ⅲ号方高剂量序贯使用较对照组小鼠排卵数目增多(P=0.003)，析因分析表明二者序贯使用有交互作用(P=0.047)、排卵数目增多与使用补肾调经Ⅱ号方高、低剂量有关(P=0.004)。逍遥组以逍遥丸高剂量、低剂量序贯使用较对照组小鼠排卵数目增多(P=0.007)，析因分析表明二者序贯使用有交互作用(P=0.046)、排卵数目增多与排卵期使用逍遥丸高、低剂量差异显著(P=0.039)有关。结论：补肾调经Ⅱ号方使阴精盛助卵泡发育成熟而导致排卵数目增多；逍遥丸低剂量疏肝理气助阴阳转化顺利可使排卵数目多。补肾法、疏肝法分别序贯使用可提高药物疗效。

补肾调经方；逍遥丸；小鼠排卵障碍；排卵数目； 补肾法；疏肝法；促性腺激素

基于“肾为先天之本” “女子以肝为先天”等中医理论以及肾虚、肝郁是导致排卵障碍性不孕的常见原因之一，课题团队对补肾法、疏肝法对女性生殖功能的影响进行了系列研究。补肾调经系列方是课题组在临床上治疗排卵障碍性月经不调、不孕症的基本方，临床疗效显著。[1-3]其中补肾调经Ⅱ号方主要用于经后期滋肾阴以促进卵泡发育，补肾调经Ⅲ号用于排卵期、黄体期温肾阳理气活血诱发排卵促进黄体功能。课题组相关研究表明补肾调经方、逍遥散可促进体外受精—胚胎移植术 ( IVF- ET)患者优质胚胎率，提高卵母细胞质量改善妊娠结局。[4]本实验在前期临床研究的基础上按照两因素两水平的析因分析探讨卵泡期、排卵期灌服补肾调经方、逍遥丸的高剂量、低剂量对促性腺激素预处理小鼠排卵数目的影响及其是否具有协同作用。

1 材料与方法

1.1 实验药物 注射用血促性素(PMSG，内蒙古赤峰博恩药业有限公司，批号081001)；注射用绒促性腺素(hCG，丽珠集团丽珠制药厂，批号090601B)；逍遥丸(河南省宛西制药股份有限公司，批号090513)，实验前将逍遥丸用蒸馏水溶成混悬液含生药0.116 9 g/mL(高剂量组，等效于临床用量的2倍)、0.058 5 g/mL(低剂量组，等效于临床用量)，4℃保存；补肾调经Ⅱ号方、补肾调经Ⅲ号方购自石家庄乐仁堂，常规煎煮浓缩，低剂量每剂中药浓缩为154 mL，高剂量每剂中药浓缩为77 mL，4℃保存。

1.2 实验动物 清洁级健康雌性昆明种小鼠102只，体质量16～18 g，购自河北实验动物中心，合格证号：2008-1-1003。普通实验室环境喂养。

1.3 主要仪器 照相机：Nikon D60，尼康株式会社；连续变倍体视显微镜：SMZ-T4型，重庆奥特光学仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 分组: 按照随机数字表将小鼠随机分为17组，每组6只。其中1组为对照组(灌服蒸馏水)，补肾组4组(卵泡期灌服补肾调经Ⅱ号方高剂量、低剂量，排卵期灌服补肾调经Ⅲ号方高剂量、低剂量)，逍遥组4组(卵泡期灌服逍遥丸高剂量、低剂量，排卵期灌服逍遥丸高剂量、低剂量)，补肾逍遥组4组(卵泡期灌服补肾调经Ⅱ号方高剂量、低剂量，排卵期灌服逍遥丸高剂量、低剂量)，逍遥补肾组4组(卵泡期灌服逍遥丸高剂量、低剂量，排卵期灌服补肾调经Ⅲ号方高剂量、低剂量)。

1.4.2 给药方法: 试验第1～3 d，补肾组和补肾逍遥丸组、逍遥组、逍遥补肾组小鼠分别灌服补肾调经Ⅱ号方(高剂量、低剂量)、逍遥丸(高剂量、低剂量)0.4 mL。试验第3 d 13:00每只小鼠腹腔注射 5 IU PMSG；第4、5 d补肾组、逍遥补肾组、逍遥组、补肾逍遥丸组小鼠分别灌服Ⅲ号方(高剂量、低剂量)、逍遥丸(高剂量、低剂量)0.4 mL；注射PMSG后48 h各组小鼠均腹腔注射5 IU hCG 。

1.4.3 检测方法:试验第6 d 8:00用颈椎脱臼法处死小鼠，开腹取出两侧输卵管和卵巢置10 cm培养皿中，暴露膨大透亮的输卵管壶腹部，置体式显微镜下，用无菌4号半针头刺破壶腹部，轻轻划出卵丘-卵母细胞复合体，相同条件下拍照，电脑读取照片计数新鲜卵子数目。

对补肾组、逍遥组、补肾逍遥组、逍遥补肾组进行两因素两水平的析因设计的方差分析，比较4组小鼠卵泡期、排卵期灌服不同中药的高剂量、低剂量对排卵数目的影响，以及不同阶段序贯不同药物、剂量有无交互作用，检验水准为P<0.05。

2 结果

2.1 对未成年小鼠进行超促排卵后输卵管壶腹部膨大情况 各组小鼠输卵管壶腹部均膨大透亮，见图1箭头所示，体式显微镜下可见：壶腹部充满白色颗粒状卵丘-卵母细胞复合体，输卵管表面可见平行输卵管方向排列的细小血管，刺破输卵管壶腹部，释放出团状聚集的由颗粒细胞包绕的卵母细胞，详见图2。

2.2 各组小鼠排卵数目 单因素方差分析表明：与对照组比较，补肾组的4组中序贯使用补肾调经Ⅱ号方高剂量、补肾调经Ⅲ号方高剂量排卵数目增多(P=0.003)；逍遥组的4组中序贯使用逍遥丸高剂量、低剂量排卵数目增多(P=0.007)。结果详见表1。

析因设计分析表明：补肾组促进卵泡发育使用补肾调经Ⅱ号方高剂量与低剂量排卵数目差异显著(P=0.004)，补肾调经Ⅱ号方、Ⅲ号方高剂量有交互作用(P=0.047)，结果详见表2；逍遥组诱发排卵使用逍遥丸高、低剂量排卵数目差异显著(P=0.039)，逍遥丸高、低剂量序贯使用有交互作用(P=0.046)，结果详见表3。

单因素方差分析还显示，与对照组比较，逍遥补肾组中的4组序贯使用逍遥丸低剂量与补肾调经Ⅲ号方高剂量排卵数也增多(P=0.013)，补肾逍遥组中的4组补肾调经Ⅱ号方高剂量与逍遥丸低剂量序贯使用虽然排卵数多(P=0.039)，但统计分析逍遥丸、补肾调经方无交互作用(P=0.838，P=0.604)。结果详见表4、表5。

图1 小鼠促性腺激素处理后的卵巢、输卵管(箭头所指部位为膨大的壶腹部)(×20)

图2 小鼠输卵管壶腹部释放出的卵丘-卵母细胞复合体(×40)

组别 排卵数P值对照组37.00±10.37补肾组Ⅱ高/Ⅲ高组71.60±19.680.00Ⅱ高/Ⅲ低组48.80±8.010.30Ⅱ低/Ⅲ高组37.00±16.791.00Ⅱ低/Ⅲ低组41.40±8.020.69逍遥组逍高/逍高组33.20±7.950.73逍高/逍低组67.60±13.240.01逍低/逍高组46.20±20.460.41逍低/逍低组52.00±14.710.18补肾逍遥组Ⅱ高/逍高组37.80±11.970.94Ⅱ高/逍低组60.60±19.830.04Ⅱ低/逍高组38.40±27.550.90Ⅱ低/逍低组51.40±20.600.19逍遥补肾组逍高/Ⅲ高组51.80±20.620.19逍高/Ⅲ低组48.60±24.430.30逍低/Ⅲ高组65.60±20.910.01逍低/Ⅲ低组58.40±20.110.24

注：P值，与对照组比较

表2 补肾组2×2 析因设计分析 (n=6)

表3逍遥组2×2析因设计分析(n=6)

组别MSFP逍遥丸低剂量2020.059.250.008逍遥丸高剂量8.450.040.847逍遥丸低剂量+逍遥丸高剂量1022.454.680.046

表4 补肾逍遥组2×2 析因设计分析 (n=6)

表5逍遥补肾组2×2析因设计分析(n=6)

组别MSFP补肾调经Ⅲ号方高剂量135.200.290.598逍遥丸低剂量696.201.490.239Ⅲ号方高剂量+逍遥丸低剂量20.000.040.838

3 讨论

成功的排卵是指有卵母细胞及其周围的卵丘颗粒细胞一起从卵巢排卵孔排出的过程。中医学称排卵期为“氤氲”或“的候”。卵泡的生长发育成熟、排卵、黄体生成与女性阴阳生长及相互转化相一致，经后期即卵泡生长，胞宫以藏为主，即肝、肾所藏之精血滋养冲任，阴长至极，重阴转阳，呈氤氲之状，此为女子排卵、种子的关键节点。

补肾调经Ⅱ号方中熟地黄、当归、白芍、山茱萸为《傅青主女科》名方养精种玉汤，为四物汤去辛温活血之川芎加酸收养阴之山茱萸而成，可达血中养阴、阴中养精之功效；女贞子、枸杞子补益肾阴；山药健脾补肾；紫河车甘温，养血、益气、补精，本方用于卵泡期可滋阴、养精血为卵泡发育提供物质基础。排卵期重阴转阳，使用补肾调经Ⅲ号方，方中仙茅为“补肾阳之专药”(《本草正义》)，淫羊藿“补肾虚，助阳”(《医学入门》)，共为君药；紫石英镇心安神、暖子宫，肉苁蓉“养命门、滋肾阴、补精血”(《本草汇言》)，菟丝子为“补脾肾肝三经要药，……，暖而能补肾中阳气”(《本草经疏》)，覆盆子补肝肾，“女子食之有子”(《药性论》)，四药助君药温肾阳、滋肾阴，共为臣药；丹参、枳壳活血理气，共为佐使。本方在排卵期使用可协助重阴转阳诱发排卵。本实验中，补肾调经Ⅱ号方、Ⅲ号方高剂量使促性腺激素预处理小鼠诱发排卵数目较多，且使用补肾调经Ⅱ号方高低剂量有区别，推测与Ⅱ号方滋肾阴、养精血进而充分促进了卵泡发育成熟密切相关。与国医大师夏桂成提出重阴有所不足，则精卵发育欠佳、排卵不利的临床经验相一致。[5]实验表明补肾调经Ⅱ号方、Ⅲ号方序贯使用具有协同作用，即可以增强疗效。从统计学角度说明补肾调经方诱发排卵的作用是使精血充足促进卵泡发育成熟的前提下诱发排卵。灌服补肾调经方的小鼠卵巢组织HE染色镜下可见较多窦状卵泡和窦前卵泡，表明补肾法有促进卵泡发育的作用，从形态学阐释了肾为先天之本、藏先天之精的理论基础。

逍遥丸为疏肝法的代表方剂，是中医临床广泛应用的“女科圣药”。方中柴胡为君，为条达肝气、疏肝解郁、调经止痛之要药，又引诸药归于肝经。当归养血和血，白芍滋阴柔肝、养血调经，三药共奏养肝以助肝用而为臣药。白术健脾益气，为脾脏补气第一要药，茯苓功善利水渗湿、健脾安神，甘草调和诸药，薄荷疏散透达肝经之郁滞，共为佐药。诸药合用，可使肝郁得疏，血虚得养，脾运得健，肝脾协调。本实验中，卵泡期使用逍遥丸高剂量、排卵期使用低剂量，二者有协同作用，即逍遥丸高剂量促进卵泡发育、低剂量诱发排卵，序贯应用可增强疗效。逍遥组中的4组，HE染色显示卵泡期使用逍遥丸高剂量较低剂量有较多的窦状卵泡，提示逍遥丸高剂量疏肝养血更有利于促进卵泡发育成熟，精血同源，体现了肝主藏血的功能，从形态学阐释肝主藏血、司血海的功能；排卵期逍遥丸低剂量可助阴阳转化诱发排卵，体现了肝主疏泄、女子以肝为先天的功能对卵子的影响。

实验中还发现一有趣的现象，逍遥丸低剂量与Ⅲ号方高剂量序贯使用、Ⅱ号方高剂量与逍遥丸低剂量序贯使用虽然排卵数也明显增多，但析因设计分析二者无交互作用，即不具有增效作用。这可能从统计学角度阐释了中医的整体观念。

[1] 杜惠兰，闫华，白凤楼，等. 补肾调经系列方周期给药治疗功能失调性子宫出血的临床研究[J]. 中国中西医结合杂志,2003，23(3)：178-181

[2] 杜惠兰，闫华，白凤楼，等. 补肾调经系列方周期给药治疗功能失调性子宫出血174例临床研究[J].中医杂志, 2004，45(7)：517-519

[3] 杜惠兰，闫华，白凤楼，等. 补肾调经系列方对功能失调性子宫出血患者生殖激素及子宫内膜激素受体的影响[J].中医杂志.,2007，48(11)：986-988

[4] 梁莹, 杜惠兰, 赵胜男,等.体外受精—胚胎移植术联合补肾、疏肝对不孕症患者活化素受体样激酶5的影响[J].中医杂志, 2014,55(1 ):34-37

[5] 夏桂成.中医临床家丛书·夏桂成[M]. 北京：中国中医药出版社，2001.40-42

(2017-05-23 收稿)

EffectofBushenTiaojingFormulaandXiaoyaoWanonOvulationNumberofGonadotrophins-PreprocessedMice

DUANYan-cangSONGCui-miaoDUHui-lan(Shijiazhuang 050200)

College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine

Objective: to explore the effect of sequential use of high and low dose ofBushenTiaojingFormula (Kidney-reinforcing and Menstruation-regulating Formula)II and III, andXiaoyaoWanon ovulation number of gonadotrophins-preprocessed immature mice. Methods: 17 groups of immature female mice were given intraperitoneal injection of pregnant mares' serum gonadotropin (PMSG) and human chorionic gonadotropin (hCG) before being fed with high and low dose of Formula II orXiaoyaoWanon 1～3 days of the experiment, and with Formula III orXiaoyaoWanon 4～5 days (control group were fed with distilled water). After 19 hours of hCG injection, the ampulla of fallopian tube is cut under the stereomicroscope, releasing fresh ovum. Take a picture and count the ovum number which was then analyzed by one-way ANOVA and factorial analysis. Results: One-way ANOVA showed that the ovulation number ofBushengroup increased after sequential use of high and low dose ofBushenTiaojingFormula II and III, compared to control group (P=0.003); factorial analysis showed that there was interaction between the two sequential use (P=0.047), and the increase of ovulation number is related to high and low dose of Formula II (P=0.004). The ovulation number ofXiaoyaogroup increased after sequential use of high and low dosage ofXiaoyaoWan(P=0.007); factorial analysis showed that there was interaction between the two sequential use (P=0.046), and the increase of ovulation number is related to the difference between high and low dosage ofXiaoyaoWanin ovulation period (P=0.039). Conclusion:BushenTiaojingFormula II can enrich yin essence which contributes to follicular maturation so to increase the ovulation number; low dose ofXiaoyaoWancan sooth liver and regulate qi which contributes to yin-yang transformation so to increase the ovulation number. The sequential therapy ofBushenandShugan(soothing liver) can improve the curative effect of the medicine.

BushenTiaojingFormula;XiaoyaoWan; ovulation failure of mice; ovulation number;Bushentherapy;Shugantherapy; gonadotrophins

R285.5

A

1007-5615(2017)05-0001-04

* 国家自然科学基金资助项目：No.81303002；河北省自然科学基金资助项目：No.H2013206117；河北省教育厅资助项目：No.Q20122008

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