基于介观量子理论的最佳PCR引物浓度计算

周德良，刘明坤，叶锋

基于介观量子理论的最佳PCR引物浓度计算

周德良，刘明坤，叶锋

（北京旌准医疗科技有限公司，北京 100176）

对PCR反应体系而言，引物浓度过高或过低对反应体系都存在严重的影响，只有合理的浓度区间才能对整个反应高效有序地进行发挥重要的作用.降低PCR引物间的量子效应有利于提高引物间PCR反应的独立性和确定性，故粒子自由程至少是相位关联长度的10倍，并由此可以得到引物反应浓度的上限；粒子非弹性散射的最大自由程是粒子运动的极限自由程，依此可以得到引物反应浓度的下限，从而确定了引物的有效浓度区间；引物浓度-扩增效率曲线一般呈单峰分布，利用黄金分割法可以精准、迅速地确定引物最佳浓度。基于上述计算方法，长20、25、30 nt的引物有效浓度区间分别为0.027～5.280、0.019～7.310、0.015～9.461 umol·L-1。引物有效浓度区间及最佳浓度对PCR反应体系的反应效率与速率、PCR产物质量等具有决定性的作用，而应用理论方法确定它们将对理论指导实验具有重要的意义。

量子相干长度；相位关联长度；引物量子浓度；黄金分割法；PCR

量子力学是研究微观粒子（如电子、原子、分子等）运动规律及其性质的物理理论，通过该理论可以获知物质的原子结构、分子结构、分子间作用力、电子运动规律等，从而可以对物质的物理性质、化学性质以及它们的微观变化进行探索。利用量子力学方法可以直接对生物大分子进行计算[1-4]，由此可以得到生物大分子的基本性质与属性，从而可以对分子间相互作用力[5-6]、电子结构反应活性[7-9]、生物大分子构象与功能等进行分析，进而获得微观体系下微观粒子的运动规律及相关属性。PCR反应即聚合酶链式反应[14-15]，主要指在DNA聚合酶作用下，以母版DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制出与母版DNA互补的子链DNA的过程，其中“延伸”过程的工作温度在345 K.PCR技术包括数字PCR[17-20]和定量PCR[21-22]，但无论哪种PCR技术，都存在循环阈值不高、扩增效率与速率不理想等问题，而导致这一问题的原因有很多，其中最主要的原因之一就是引物浓度的选择问题。当引物浓度过高，则增加反应体系的无序性与噪声强度；当引物浓度过低，则降低反应体系的信噪比与产物质量，因此，有效的引物浓度区间及最佳浓度对PCR反应效率与速率、PCR产物质量等至关重要。

采用介观量子理论，通过获得量子相干长度、相位关联长度、弹性散射极限自由程等基本性质对微观体系下引物的有效浓度区间进行了量子计算，从理论水平上得到了高置信度的引物有效浓度区间，然后采用黄金分割法对引物有效浓度区间进行优选，从而可以确定引物最佳浓度。该量子计算方法不仅提供了引物有效浓度区间及最佳浓度的理论建立方法，同时对提高PCR反应效率与速率、PCR产物质量等具有重要意义。

1 引物浓度大小对PCR反应体系的影响

对PCR反应体系而言，合理的引物浓度区间对PCR反应的扩增效率与速率至关重要，浓度太高或太低都存在自身的优势与不足，对PCR反应本身产生重要的影响。

高引物浓度对PCR反应的优、缺点[15-16]总结如下：

优点：

（1）提高粒子流强度，使反应体系的信噪比提高；

（2）提高引物与靶基因序列之间的结合配对效率；

（3）改善PCR扩增产物的产出及质量。

缺点：

（1）增加系统熵，使系统倾向于更加无序；

（2）引入高噪声强度；

（3）导致非特异性的引物结合和非期望PCR产物的产生。

低引物浓度对PCR反应的优点与高引物浓度的缺点表述相反，而低引物浓度的缺点则与高引物浓度的优点表述相反。

由此可见，引物浓度偏高或偏低存在明显的双重作用：既对PCR反应产生了有利因素，但又对PCR反应造成了不可忽略的负面影响。因此，为保证反应体系高效有序的进行，引物浓度不宜过高或过低，只有合理的浓度区间才能对PCR反应的扩增效率与速率起到决定性作用。

2 量子相干长度和相位关联长度

量子相干长度[10-11]指粒子弹性散射的平均自由程，其满足公式如下：

其中ħ为约化普朗克常数，满足ħ=h/2π.

相位关联长度[12-13]指粒子非弹性散射的平均自由程，其满足公式如下：

其中h为普朗克常数；m为微粒质量；k为玻尔兹曼常数；T为反应体系温度。

在PCR反应过程中，引物浓度对整个扩增反应的进行具有重要作用，为计算引物浓度的有效区间，假设引物长度为20 nt，则其分子量为6 500 Dalton，质量m为1.08×10-23kg，长度为6.8 nm。由于DNA复制出现在“延伸”过程，故将“延伸”步骤工作温度T（345 K）定为反应体系工作温度，于是，根据（1）式代入各相应参数，可得到引物的量子相干长度为lq=1.7×10-3nm，其远小于引物尺寸，说明整个引物体系属于非全同粒子体系。

根据（2）式，代入各相应参数，可得到引物的相位关联长度为Lφ=6.8 nm，其与引物长度相近，说明整个反应体系经典效应与量子效应并存，且经典效应强于量子效应。

3 引物最大浓度

相位关联长度是体系有无量子效应的表征，当粒子平均自由程远大于相位关联长度时微观粒子体系将只服从经典效应，不具有量子效应。为了提高引物间PCR反应的独立性与确定性，必须减弱引物体系的量子效应、增强其经典效应，从而可以有效地提高PCR反应的扩增效率与速率。因此，应使引物的实际自由程L远大于相位关联长度Lφ=6.8 nm，故引物实际自由程至少是相位关联长度的10倍，即取值68 nm。

粒子自由程L与引物浓度C满足如下关系式：

其中n为引物的物质的量；V为反应体系的体积；NA为阿伏伽德罗常数；L为粒子/引物的实际自由程，单位为nm。

将实际自由程L=68 nm代入（3）式可得引物的最大浓度为 5.28 umol·L-1。

4 引物最小浓度

相位关联长度指出了微观粒子非弹性散射的平均自由程，但为了计算引物的最低浓度，必须得到引物非弹性散射的最大自由程Lmax，这样，带入（3）式即可得到引物的最低浓度。

PCR反应体系是液体环境，引物在溶液中运动并与DNA模板相结合以实现DNA扩增过程。在液态环境下，引物运动受到阻力作用，且阻力满足斯托克斯定律公式：

F阻=3πηdv （4）

上式中η为液体的粘滞系数/粘度，单位为P或Pa·s（1 P=0.1 Pa·s）；由于 PCR 反应体系是须经大量水进行稀释的液体环境，其主要成分是水，故令η为水的粘滞系数 6.56×10-4pa·s；d 为引物直径，为 0.8 nm；v为引物运动速度。

在PCR反应体系内，引物的平均热运动能量E热动能满足

其中k为玻尔兹曼常数；T为345K，于是得E热动能=7.14×10-21J.

在PCR反应体系内，引物运动速度v满足

其中引物质量m为1.08×10-23kg；v为引物热运动速度。将（5）式带入（6）式可得引物热运动速度为v=36.36 m·s-1。

将 η=6.56×10-4pa·s、d=0.8 nm 和 v=36.36 m·s-1带入（4）式，可得引物在PCR反应体系内的粘滞阻力为 F阻=1.8×10-10N。

弹性散射的最大自由程L弹满足

将（4）、（5）式结果带入（7）式得 L弹=3.96×10-2nm。

在微粒体系内，粒子在进入非弹性散射之前一般会经历约104次左右弹性散射，于是非弹性散射的最大自由程Lmax满足

将L弹=3.96×10-2nm带入上式得Lmax=396 nm，将Lmax带入（3）式，于是得引物的最小浓度为0.026 7 umol·L-1。

由此可知，对于20 nt长的引物其有效浓度区间为0.027～5.280 umol·L-1， 有效自由程区间为 68～396 nm。如果将引物长度设为25 nt和30 nt，而延伸过程仍工作在345 K，则它们的有效浓度区间仍按上述过程进行计算，结果见表1。

表1 不同引物长度对应的有效浓度区间Table 1 The effective concentration range of primers of different lengths

目前Sigma-Aldrich（西格玛奥德里奇）、Bio-Rad（伯 乐）、QIAGEN （天 根）、New-England-Biolabs（NEB）、生工等国内外大型生物大公司常用的PCR引物浓度区间为 0.05～1.0 umol·L-1[15]，而且有文献表明引物浓度为2.2 umol·L-1[16]时PCR副产物产量最少，由此表明提供的引物浓度量子计算方法是比较合理的。

5 引物最佳浓度

实验得到了不同长度引物的有效浓度区间，其中20 nt长引物的有效浓度区间为[0.027，5.280]（单位umol·L-1），超出这个浓度之外，从理论上讲引物的扩增效率就会降低，甚至无法实现正常扩增，而这个浓度区间对应的有效自由程区间为[68，396]（单位nm）。

引物浓度-扩增效率（x-y）曲线一般在有效浓度区间内满足单峰分布，为了在有效浓度区间[0.027，5.280]内精确、迅速地确定最优浓度，采用黄金分割法进行优选分析，而优选过程如下：

有效浓度区间[0.027，5.280]关于区间中点对称的两个黄金分割点分别为2.034 umol·L-1（0.027+5.253*0.382）和3.273 umol·L-1（0.027+5.253*0.618），实验比较两个黄金分割点的扩增效率，如果2.034的扩增效率更高，则将区间（3.273，5.280]删去并将余下区间[0.027，3.273]作为一次优化区间（2.034仍是区间 [0.027，3.273]的黄金分割点），否则删去区间[0.027，2.034）；继续实验比较新浓度区间相互对称的两个黄金分割点的扩增效率，并按前述要求删去低扩增效率黄金分割点某一侧不含另一黄金分割点的全部区间；重复上述过程，直到得到最优浓度。

在上述优化过程中，令优化过程的迭代次数为9，这样有效浓度区间[0.027，5.280]经迭代优化后变为区间宽度为5.253×0.6189=0.069的优化区间。令最优浓度取0.05n（n为正整数），则最优引物浓度即优化区间内满足0.05n的引物浓度，但若优化区间内包含两个0.05n，则取距区间端点更远的一点作为最优引物浓度。

6 总结

PCR引物浓度过高，则增加反应体系的无序性与噪声强度；引物浓度过低，则降低反应体系的信噪比与扩增产物质量。无论引物浓度偏高或偏低，一方面它们都对PCR反应有利，但另一方面它们又都对PCR反应带来了严重的负面作用。因此，建立了一种量子计算方法对PCR反应的引物有效浓度区间及最佳浓度进行计算，而计算原理及方法如下：

相位关联长度是经典效应与量子效应的分界线，当引物平均自由程远大于相位关联长度时微观体系将只服从经典效应，这样可以提高引物间PCR反应的独立性与确定性，因此，引物自由程应满足至少是相位关联长度的10倍，并依此可以得到有效浓度区间的上限值；粒子非弹性散射的最大自由程是粒子运动的极限自由程，依此可以得到有效浓度区间的下限值.因此，对于20 nt长的引物而言，其有效浓度区间为0.027～5.280 umol·L-1， 有效自由程区间为68～396 nm.引物浓度-扩增效率曲线一般呈单峰分布，利用黄金分割法可以准确、迅速地确定引物最佳浓度，并对优化过程要求迭代优化次数为9，优化精度为0.069，而最优浓度取0.05n（n为正整数）。

应用上述方法，可以得到不同引物长度、不同反应温度对应的引物有效浓度区间及最佳浓度，将对提高PCR反应效率与速率、PCR产物质量等具有决定性的作用，同时该量子计算方法从实际理论出发计算引物有效浓度区间及最佳浓度，对理论指导实验具有一定的指导价值。

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Calculation of Optimal PCR Primer Concentration Based on Mesoscopic Quantum Theory

Zhou Deliang，Liu Mingkun，Ye Feng
（BeiJing Genome Precision Technology Co.，Ltd，Beijing 100176）

In PCR reaction system，the extreme high or low primer concentration would have very serious influences on reaction systems，but the rational concentration range would play a significant role on effective and orderly proceeding of reaction systems.It was beneficial to enhance the independence and certainty of PCR reaction that decreasing quantum effect among primers，so the free path of particles must be phase correlation length at least 10 times，and the maximum concentration of primers could be obtained based on it.The maximal free path of inelastic scattering of particles was ultimate free path of particles moving，which could calculate the minimum concentration of primers，then the effective concentration range for primers could be determined.The primer concentration-reaction efficiency usually appeared as unimodal distribution，and the optimum primer concentration could be precisely and quickly confirmed by the golden section method.Based on the above conclusions，the effective concentration range for primer of 20、25、30 nt were 0.027～5.280、0.019～7.310、0.015～9.461 umol·L-1respectively.The effective concentration range and optimal concentration could play the decisive role on the reaction efficiencies and velocities of PCR、the quality of PCR product，etc，and using theory method to determine them would be important for theories leading experiments.

quantum coherence length；phase correlation length；primer quantum concentration；golden section method；PCR

Q61

A

1002-2090（2017）05-0074-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.018

2017-04-06

周德良（1985-），男，工程师，内蒙古大学毕业，现主要从事量子物理与量子生物学方面的研究。