大黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖与诱导凋亡的研究

吴丹丹 ，朴仙姬 ，刘畅 ，罗英花 ，孙虎男 ，臧延青 ，金成浩

大黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖与诱导凋亡的研究

吴丹丹1，朴仙姬2，刘畅1，罗英花1，孙虎男1，臧延青1，金成浩1

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.哈医大五院）

研究大黄素对宫颈癌Hela细胞的增殖与凋亡的影响。通过MTT法检测Hela细胞的存活率，Annexin V-FITC/PI双染法及流式细胞术检测Hela细胞凋亡，蛋白质免疫印记法检测p-JNK、JNK、Bcl-2、pro-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白的表达。大黄素对Hela细胞的增殖抑制效果呈浓度依赖性。Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术结果表明大黄素能够诱导Hela细胞凋亡。蛋白质免疫印记法表明，随着药物处理时间的增加，p-JNK、cleaved-caspase-3的蛋白质表达量逐渐增加，Bcl-2、procaspase-9的蛋白表达量逐渐减少。在实验条件下，大黄素可以抑制Hela细胞的增殖，诱导细胞凋亡。

大黄素；人宫颈癌Hela细胞；JNK信号通路；细胞凋亡

宫颈癌（Cervical Cancer）是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌而位居第二，严重威胁妇女的健康和生命[1]。在我国，宫颈癌占妇女恶性肿瘤的首位，而且其发病率呈上升趋势[2]。目前，宫颈癌治疗手段一般是以手术治疗、放疗为主，化疗为辅。但放、化疗后的不良反应及肿瘤对化疗药物的耐药性已成为当今治疗肿瘤的主要问题。因此，寻找治疗效果好且不良反应小的药物已成为医药学领域研究的热点。

大黄素是一种蒽醌类衍生物，主要来源于蓼科植物掌叶大黄根茎，其化学名称为1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌，是中药大黄的主要有效单体。大黄素除了具有泻下、抗菌、消炎等作用[3]，还具有抗肿瘤[4-5]药理作用。大黄素对若干肿瘤细胞都具有良好的抑制生长的活性，但对不同的细胞系，抑制生长的机制有所不同。尽管国内外一些学者对大黄素抗肿瘤的机理作了一定的研究和探讨，但是大黄素对宫颈癌细胞的药理作用尚不清楚，国内外鲜有报道。通过MTT法，Annexin V-FITC/PI双染色法，蛋白质免疫印记法等生物学方法阐明大黄素对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用，促进细胞凋亡作用及其相关信号通路。

1 材料和方法

1.1 细胞

Hela细胞（购自上海中科院细胞研究所），由本实验室冻存。

1.2 主要试剂仪器

主要试剂：大黄素、DMSO均购自美国Sigma公司，MTT购自美国Amresco公司，DMEM高糖液体培养基、胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗、PBS均购自美国HyClone公司，FBS购自美国Gibco公司，抗体βactin、JNK、p-JNK、Bcl-2、cleaved-caspase-3、procaspases-9、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG均购自美国Santa Cruz公司，ECL化学发光试剂购自美国Thermo公司，其余试剂均为国产分析纯。

主要仪器：CO2培养箱、高压蒸汽灭菌锅，日本SanYo公司；390302倒置显微镜，德国Leica公司；EVOS FL型全自于动智能成像系统，Life Technology公司；MicroChemi4.0型化学发光型凝胶成像系统，以色列DNR成像系统有限公司；电泳仪、半干转印仪（Bio-rad），美国伯乐公司；FACSCalibvr型流式细胞仪，美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 宫颈癌Hela细胞的复苏与扩增

将Hela细胞从液氮罐中取出。将冻存管迅速地放入37℃水浴锅中顺时针旋转融化，将冻存管中的细胞吸出，加入含有预热的4 mL DMEM培养液的15 mL离心管中，1 200 rpm，离心3 min。弃上清液后，重新加入10 mL DMEM培养液吹打均匀后，加到10 cm培养皿中晃动使细胞均匀平铺于培养皿底，37℃，5%CO2培养箱中培养。时刻观察细胞的长势，当细胞长满培养皿的70%～80%时进行传代培养。弃废液后用PBS洗去培养皿中残留的血清后，再用0.25%的T/E胰蛋白酶消化贴壁的细胞，使细胞从培养皿上脱落下来。随后在细胞中加入培养液阻断消化，离心（3 min，1 200 rpm），加培养液吹打均匀后加到10 cm培养皿中前后左右晃动均匀后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养[6]。

1.3.2 MTT法检测细胞存活率

收集处于对数期的细胞，用培养液调整细胞浓度后种入96孔板中使得每孔细胞数量在1×104个左右。置于5%CO2、37℃培养箱里孵育16～24 h，之后用含有1%FBS的DMEM培养液血清饥饿培养2 h左右，每孔分别加入1 μL不同浓度的大黄素（1、3、10、30、100 μmol·L-1），并设置对照组（加入等量的1 μL DMSO），每组设5个复孔，并设置空白调零孔（加入100 μL DMSO）。放入培养箱中培养24 h，在倒置显微镜下观察细胞状态，每孔加入15～20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1，即 0.5%MTT），继续培养 2 h。 将培养液吸出，用PBS洗1～3次，每孔加入100 μL DMSO显色，在摇床上混匀15 min，用酶标仪测量吸光度（A570）值，计算细胞存活率[7]。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡

将对数生长期的Hela细胞接种在6孔板中（1×105个·孔-1），当细胞满度达到70%时按时间梯度（0、3、6、12、24 h） 加入浓度为 30 μmol·L-1的大黄素处理。弃上清后，用PBS洗1～3次，每孔加入194 μL Annexin V-结合液。 加入 2 μL Annexin V-FITC，轻轻地混匀，再加入4 μL碘化丙啶（PI）染色液，染色10～15 min后在荧光显微镜下观察照相。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡

采用流式细胞计数法，将对数生长期的Hela细胞接种在6孔板中（1×105个·孔-1），贴壁生长24 h后，按时间梯度（0、3、6、12、24 h）每孔加浓度为 30 μmol·L-1的大黄素。使用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，将细胞转移至2 mL离心管中，6 000 rpm离心5 min。弃上清，1 mL PBS漂洗后，再次离心。用195 μL的Annexin V结合液重选细胞。加入3 μL Annexin VFITC和2 μL PI，轻轻混匀，避光孵育15 min。 加入300 μL PBS缓冲液后，立即通过流式细胞仪检测分析[8]。

1.3.5 Western blot方法检测细胞凋亡相关蛋白表达量变化

将对数生长期的Hela细胞接种在6孔板中（1×105个·孔-1），培养 16～24 h 后，按时间梯度（0、6、12、24 h） 每孔加30 μmol·L-1浓度的大黄素。 弃掉上清液，加100 μL细胞裂解液（含有4种蛋白酶抑制剂AEBSF、pepstatin、leupeptin 和 aprotinin，lysis buffer，β-ME）冰浴裂解细胞后，12 000 rpm、4 ℃离心30 min。取上清液，用Bradford法测定蛋白质浓度。取30 μg蛋白与5×buffer混合后，煮沸5 min。用12%SDSPAGE电泳分离，半干转印到NC膜上，5%脱脂乳封闭1 h， 分别与p-JNK、JNK、Bcl-2（稀释比例为1∶2 500）、β-actin（稀释比例为 1∶4 000）、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9（稀释比例为 1∶2 500）4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗5次，每次5 min。加入HRP标记山羊抗 兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗（稀释比例为1∶2 000）室温孵育2 h。TBST洗5次，每次5 min，ECL化学发光试剂显色，然后利用DNR化学发光型凝胶成像系统照相，内参采用β-actin[9]。

蛋白相对表达强度=目标蛋白表达强度/β-actin蛋白表达强度。

1.3.6 统计学方法

采用spss17.0版软件进行数据分析。数据用x¯±s表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义（*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001）。

2 实验结果

2.1 大黄素对Hela细胞生长的影响

MTT 法 结 果 显 示 ， 不 同 浓 度（1、3、10、30、100 μmol·L-1）的大黄素处理 Hela 细胞 24 h，发现大黄素对Hela细胞的生长有明显的抑制作用，并且呈一定的剂量分布，大黄素的浓度越高，细胞存活率越低，与对照组（0 μM）比较具有显著差异（P＜0.001）。经计算大黄素对Hela细胞的IC50值为15.59 μmol·L-1（图 1）。

图1 不同浓度大黄素对Hela细胞杀伤作用Fig.1 Lethal effect of emodin of different content on Hela cells

2.2 大黄素对Hela细胞的形态学影响

细胞形态学结果显示，用30 μmol·L-1浓度的大黄素处理 Hela细胞（0、3、6、12、24 h）后，在显微镜下进行观察发现，随着药物处理时间的增加，细胞出现明显的体积变小，皱缩，核质浓缩，核碎裂以及凋亡小体的形成等凋亡形态学特征（图2）。

2.3 大黄素对Hela细胞荧光染色的影响

Annexin V-FITC/PI双染法结果表明，用30 μmol·L-1的大黄素处理细胞（0、3、6、12、24 h）后，发现随着处理时间的增加，荧光强度越强，凋亡细胞越多，与对照组（0 h）比较具有显著性差异。说明大黄素对Hela细胞具有促进凋亡的作用（图3）。

图2 Hela细胞的形态学观察（100×）Fig.2 Morphology observation of Hela cells（100×）

图3 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况（200×）Fig.3 Apoptotic effect of emodin on Hela cells by Annexin V-FITC/PI double staining

2.4 大黄素对Hela细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，用终浓度为30 μmol·L-1的大黄素处理 Hela细胞不同时间（0、3、6、12、24 h）后，Hela细胞出现明显的早期凋亡现象，随着药物处理时间的延长，与对照组（0 h）比较，凋亡峰逐渐右移，且处理药物时间越长，凋亡峰右移越显著，说明大黄素可以诱导Hela细胞发生凋亡，并呈时间依赖性（图 4）。

图4 流式细胞仪检测大黄素对Hela细胞凋亡的影响Fig.4 The apoptotic effect of emodin on Hela cells by Flow cytometer

2.5 大黄素对Hela细胞凋亡相关蛋白表达量的影响

Western blot结果表明， 用终浓度为 30 μmol·L-1的大黄素处理 Hela细胞不同时间（0、6、12、24 h）后，磷酸化的JNK、被剪切的cleaved-caspase-3表达水平显著升高；大黄素终浓度为 30 μmol·L-1时，显著降低未活化的pro-caspase-9及Bcl-2蛋白的表达水平，并呈浓度依赖性，与对照组（0 h）比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。说明大黄素可以通过JNK信号途径诱导细胞凋亡（图5）。

3 讨论

c-Jun氨基末端激酶（JNK）家族是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族成员之一，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是哺乳动物体内丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）超家族的一员[10]。诸多研究表明，JNK能介导多种细胞外刺激诱导的凋亡，参与许多细胞凋亡的发生，如细胞应激，生长因子[11]。JNK信号通路主要通过调控胞浆中的底物诱导细胞凋亡，如磷酸化并激活Bax等促凋亡因子或磷酸化并抑制Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡的Bcl-2家族成员，激活线粒体依赖的细胞凋亡通路[12]。早期研究发现，多种促炎因子可以激活Hela细胞中的p38/MAPK信号通路，促进抑癌基因c-myc的表达，从而启动Hela细胞的凋亡[13]。实验通过MTT法检测大黄素对Hela细胞的生长起抑制作用，且呈浓度依赖性，药物浓度越高，细胞存活率越低（图1）。通过大黄素对Hela细胞处理后的形态观察发现，随着时间的增加，细胞明显出现体积变小，皱缩，核质浓缩，核碎裂以及凋亡小体的形成等凋亡形态学的改变（图2）。Annexin V-FITC/PI双染法及流式细胞术进一步验证发现，随着药物处理时间的增加，荧光强度越明显，凋亡峰右移越明显。说明大黄素对Hela细胞有促进凋亡的作用（图3、图4）。实验Western blot结果显示促进细胞凋亡作用的剪切的cleaved-caspase-3、磷酸化的JNK的蛋白质表达量逐渐增加，而抑制凋亡作用的Bcl-2、pro-caspase-9的蛋白质表达量逐渐减少，与先前的研究相符（图5）。研究结果说明，大黄素是通过JNK介导的线粒体依赖性的信号转导通路诱导Hela细胞凋亡。

图5 Western blot检测大黄素对Hela细胞凋亡相关蛋白的影响Fig.5 Effect of emodin on the proteins associated with Hela cells apoptosis by western blot

4 结论

综上所述，研究结果阐明大黄素可抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖，诱导其凋亡。这仅是对大黄素抑制人宫颈癌细胞增殖和诱导凋亡影响的初步研究，尚需展开进一步研究，为今后宫颈癌及其他癌症的治疗提供理论基础。

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Effects of Emodin on Proliferation and Apoptosis of Cervical Cancer Hela Cells Lines

Wu Dandan1，Piao Xianji2，Liu Chang1，Luo Yinghua1，Sun Hu'nan1，Zang Yanqing1，Jin Chenghao1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319;2.Department of Gynaecology and Obstetrics，The fifth Affiliated Hospital of Harbin Medical University）

To investigate the inhibitory effect of emodin on the proliferation of human cervical cancer，the viability of Hela cells was determined by MTT assay.Cells apoptosis were observed by Annexin V-FITC/PI staining and FCM.The expression levels of p-JNK，JNK，Bcl-2，pro-caspase-9 and cleaved-caspase-3 were determined by Western blotting.Emodin could inhibit the proliferation of Hela cells and in a dose-dependent manner.Annexin V-FITC/PI double staining and FCM results showed that emodin induced Hela cell apoptosis.In addition，it was suggested that western blot results showed that the expressions of p-JNK，cleaved-caspase-3 kept increasing，while Bcl-2，pro-caspase-9 decreased.Under this experimental condition，emodin could inhibit the proliferation of Hela cells and induce apoptosis by up-regulation JNK signaling pathway.

emodin;human cervical carcinoma Hela cells;JNK pathway;apoptosis

Q78

A

1002-2090（2017）05-0069-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.017

2016-07-25

黑龙江八一农垦大学研究生科研创新项目（YJSCX2016-Y52）；黑龙江省自然基金项目（LC2015036）；黑龙江省博士后科研启动项目（LBH-Q13132）；学成、引进人才科研启动计划项目（XYB2013-24）。

吴丹丹（1991-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2014级硕士研究生。

金成浩，男，教授，博士研究生导师，E-mail：jinchenghao3727@qq.com。