大庆龙凤湿地一株新型δ-变形菌纲趋磁螺菌的发现

张衡 ，王芙仙 ，王春丽 ，陈志宝

大庆龙凤湿地一株新型δ-变形菌纲趋磁螺菌的发现

张衡1，2，王芙仙2，王春丽1，陈志宝1

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.中国科学院地质与地球物理研究所，地球与行星物理重点实验室）

通过对大庆龙凤湿地中趋磁细菌的首次研究，发现了一株新型趋磁螺菌，它能够在细胞内合成子弹头形磁小体，成分为磁铁矿，呈单链排列，16S rRNA基因系统发育分析，该趋磁细菌属于变形菌门中的δ-变形菌纲，是目前国内在东北地区第一例、内陆第三例发现的属于δ-变形菌纲的趋磁细菌。研究揭示了大庆地区可能蕴含丰富的趋磁细菌资源，δ-变形菌纲趋磁细菌在该地区的首次发现对龙凤湿地的生态环境认识也具有一定的指示意义。

趋磁细菌；δ-变形菌纲；龙凤湿地；16S rRNA；透射电子显微镜

趋磁细菌（Magnetotactic bacteria，MTB）广泛存在于全球的水生环境的表层沉积物或具有化学梯度分层环境的水体中，是一类能沿地磁场或外加磁场运动的革兰氏阴性细菌，趋磁细菌的这个行为被称为趋磁性（Magnetotaxis）[1]。通过趋磁性，研究者能将趋磁细菌从自然样品中富集和磁分离[2]。趋磁细菌的趋磁性是因为其能够在细胞内通过生物控制矿化合成有膜包被的，单磁畴的磁铁矿（Fe3O4）或胶黄铁矿（Fe3O4）磁性晶体颗粒，即磁小体[3-4]。它是迄今发现的唯一能利用地磁场定向和在细胞内矿化合成纳米级磁铁矿或胶黄铁矿的原核微生物，是研究微生物控制矿化和微生物-矿物相互作用的典范[5]。通过对趋磁细菌多样性及其生物矿化机制的深入研究，能够为我们更好的了解生物矿化作用，认识其在铁、硫、氧等元素地球化学循环中和维持地球生态系统功能方面的重要作用[6]。研究发现，趋磁细菌极其多样，从形貌上讲有球菌、杆菌、弧菌、螺旋菌和多细胞形态细菌；从系统进化上讲，迄今发现的趋磁细菌分属于细菌域中的四个门类：变形菌门、硝化螺旋菌门、Omnitrophica门（暂定分类单元OP3）和Latescibacteria门（暂定分类单元WS3），其中变形菌门中趋磁细菌分布在的 α-、δ-、γ-三个纲中[7]。 目前发现报道的 δ-变形菌纲趋磁细菌均属于硫酸盐还原细菌，从形态上讲主要可分为两大类：一类是由10～30个细胞组成的多细胞趋磁细菌（MMP）；另一类则是常见的单细胞的趋磁细菌。前者只在海洋中被发现[8]，后者目前国内只在西安的护城河和未央湖中发现并报道[9-10]。

近期，马如霞等[11]对大庆龙凤湿地的沉积物中的氨氧化的细菌和古菌进行了研究报道，研究则综合使用光学显微镜、电子显微镜和分子生物学技术，对大庆龙凤湿地中的趋磁细菌进行研究，发现了一株新型的δ-变形菌纲的趋磁细菌，该细菌为螺旋菌，能够在体内生物控制矿化合成子弹头状的磁铁矿磁小体，是目前国内在沼泽湿地中发现的第一株δ-变形菌纲的趋磁细菌，也是第一株螺旋状的δ-变形菌纲趋磁细菌，对于丰富国内趋磁细菌的多样性以及认识湿地生态环境具有一定的指示意义。

1 材料和方法

1.1 环境中趋磁细菌样品的采集、储存和检测

研究从大庆龙凤湿地自然保护区内选取了一处水深约两米的沼泽，采集水体的表层沉积物样品，将样品按照沉积物：原位水=1∶2的比例装入550毫升的采样瓶中，带回实验室，松开瓶口在避光处室温存放。记录采样点坐标、采样时间等信息，使用盐度计和pH计测量记录原位水的盐度和pH值。

对实验室中储存的样品，每隔3～5 d，使用5 mL的一次性的塑料吸管，在样品的泥水交界面处吸取沉积物，然后采用悬滴法检测样品中的趋磁细菌种类及数量变化[12]。检测方法：将样品在磁场中富集约15 min，富集后的样品放在光学显微镜下对液滴两边富集的趋磁细菌，采用奥林巴斯BX51型显微镜进行观察并拍照记录[13]。

1.2 环境中趋磁细菌的富集

趋磁细菌的收集可以采用毛细管和磁分离器[14]，研究中采用磁分离器收集沉积物中的趋磁细菌，收集过程中使用的所有仪器材料需要提前清洗灭菌，对于检测发现含有数量较多的趋磁细菌样品，将采样瓶中上部的原位水移入到一个干净的烧杯中，原位水需剩余0.5 cm，选用5 mL的移液枪，将剩余的原位水与瓶中1～2 cm深的沉积物搅拌成泥浆，转移至趋磁细菌的分离器中，分离器连接离心管的一端微微上扬，距离分离器两端5 cm处放置一对条形铁氧体磁铁，由于北半球的趋磁细菌趋北运动，所以在靠近离心管的一端将磁铁的S极面向分离器，在靠近分离器的一端将磁铁N极面向分离器，形成一个定向的磁场，使样品内的趋磁细菌定向移动到离心管内，富集1.5 h，取下离心管，12 000 rpm离心2 min，去除上清，PBS缓冲液清洗两次，最后浓缩至50 μL得到磁富集后的趋磁细菌样品。

1.3 纯化后趋磁细菌样品的处理

将富集纯化后的趋磁细菌样品分成三份：制备透射电子显微镜样品、制备PCR模板、固定保存。取1～2 μL样品滴在铜网的正中心，室温静置30 min后，使用蒸馏水洗去铜网表面的杂质，待铜网干燥后移至铜网盒中，进行透射电子显微镜观察和测量；取10 μL的样品于200 μL离心管中，使用PCR仪设置98℃加热10 min，作为PCR模板；除去电镜和扩增模板使用，剩下的所有趋磁细菌样品使用终浓度1%多聚甲醛于4℃固定过夜，清洗后存放在-20℃备用。

1.4 透射电子显微镜观测

透射电子显微镜实验在JEM-2100HR型透射电镜上完成，实验的加速电压为200 kV。该电镜还配备了牛津X射线能谱仪（型号Oxford X-Max 80），在微纳米尺度上对样品进行形貌观测的同时，对目标区域进行化学成分分析。

1.5 16S rRNA基因的扩增、测序及系统发育树的构建

使用细菌16S rRNA基因通用引物27F、1492R进行扩增[15]，扩增体系和反应步骤如Lin等人所述[16]，然后构建出其16S rRNA基因克隆文库，在文库中随机挑选克隆送往公司完成测序，测序结果拼接后去除质粒部分，使用NCBI的BLAST比对剔除非趋磁细菌序列，趋磁细菌按照98%划分OTU，使用MEGA 7.0软件将序列比对分析后，使用比邻法构建系统发育进化树，自展系数选取1 000[17]。

2 结果

2.1 沉积物样品采集信息

样品采集时间为2015年7月，采样地点位于大庆龙凤湿地自然保护区内，具体坐标北纬46°31′57.8″，东经 125°11′57.1″，利用盐度计和 pH 计测得原位水的盐度为1.93 ppt，pH值为7.82。

2.2 趋磁细菌的检测、富集和形态观测

如图1所示，利用悬滴法对大庆龙凤湿地的沉积物样品进行观测，在光学显微镜下发现样品含有一类螺旋形的趋磁细菌为优势菌群，数量约为103～104个·cm-3，为趋北运动的趋磁细菌。对磁分离后的趋磁细菌染色后利用光学显微镜观测，发现这类趋磁螺菌比例超过95%，暂时命名为LFSHDR-1。透射电镜观测显示，LFSHDR-1为螺旋状，细菌长度为2.5～4.3 μm，直径为 0.5～1.1 μm，通常在细胞内合成1条磁小体链，含有20～50颗子弹头状的磁小体，磁小体形状大小差异较为明显，成熟后的磁小体长度能达到80 nm，其宽度可达30 nm。透射电镜X-射线能谱分析显示，磁小体的成分为铁和氧，是磁铁矿（图 2）。

图1 大庆龙凤湿地样品中趋磁细菌的光学显微镜和透射电镜照片Fig.1 Optical microscopy images and transmission electron microscopy images of magnetotactic bacteria from Daqing Longfeng wetland samples

图2 样品中趋磁螺菌磁小体X-射线能谱图Fig.2 The X-ray energy spectrum of magnetotactic magnetism in samples

2.3 趋磁细菌的系统发育

由于光学显微镜和电子显微镜观测结果均显示样品中的趋磁螺菌为优势菌，我们将磁分离后的趋磁细菌进行DNA提取和16S rRNA基因扩增，并建立单克隆文库。从单克隆文库中任意挑选了40个进行16S rRNA基因测序，排除载体序列和质量较低的序列后，获得32条高质量的序列，约含1 491个碱基，将这32条序列两两比对发现序列之间相似度非常高（大于99%），说明这些序列为同一类群，因此归类为一个OTU，从该OTU中选取了1条代表性的序列命名为LFSDR-1，与已知的代表性序列构建系统发育进化树（图3）。通过NCBI进行BLAST同源性比对，发现与已发表的δ-变形菌纲的趋磁细菌具有最高的相似度，在95%～96%，预示该菌为一株新型的δ-变形菌纲趋磁细菌。

图3 趋磁细菌16S rRNA基因系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree of magnetotactic bacteria 16S rRNA genes

3 讨论与结论

研究综合使用光学显微镜、透射电子显微镜和分子生物学技术，对大庆龙凤湿地采集的沉积物样品进行检测研究，发现了一株新型的螺旋形的趋磁细菌LFSHDR-1，其与Christopher等[18]在美国一个咸水湖报道的δ-变形菌纲的趋磁螺菌在菌体和磁小体形态上都非常相似，且通过16S rRNA分析比对其序列相似度在95%～96%，同为NCBI数据库中相似度比对最高的序列，说明该菌为一株新型的δ-变形菌纲趋磁细菌。δ-变形菌纲报道的较少，除去对海洋沉积物中MMP的报道，国内仅在西安发现报道了该种趋磁细菌，且龙凤湿地地处高纬度，水体偏盐碱性，预示着大庆地区可能有更多丰富和独特的趋磁细菌资源，有待进一步的研究。

透射电子显微镜观察发现该趋磁细菌的磁小体虽然归类为子弹头状的磁小体，但是同一菌体内不同磁小体之间形状差异显著，子弹头磁小体也并非朝着同一个方向进行生长，预示其有着不同的生物矿化机制[19]；同时国内西安未央湖和护城河报道的δ-变形菌纲的趋磁细菌90%以上都是杆菌，所以该菌的发现不仅丰富了国内趋磁细菌的多样性，同时为趋磁细菌的生物矿化机制研究提供新的材料。从生理生化特征上讲，δ-变形菌纲趋磁细菌均属于硫酸盐还原细菌（SRB）。硫酸盐还原菌是一类非常重要厌氧微生物，在有机质的生物降解过程中扮演重要角色，也能将废水中的硫酸盐还原成H2S，净化水体[20]。LFSHDR-1在大庆龙凤湿地沼泽环境中的首次发现，对于揭示其可能与该湿地沉积物中有机物降解和促进碳、氮和硫的地球化学循环相关有重要意义。

下一步可以利用宏基因组测序、生物信息学和更先进的显微学和显微谱学方法对龙凤湿地中所发现的LFSHDR-1和其他类型的趋磁细菌进行进一步的深入研究，了解其矿化基因及其矿化机制；并继续开展对大庆地区趋磁细菌多样性和分布的研究，为趋磁细菌的研究开发提供更多的材料和理论依据。

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Detection of a Novel Magnetotactic Bacterium Belong to δ-Proteobacteria in Longfeng Wetland of Daqing City

Zhang Heng1，2，Wang Fuxian2，Wang Chunli1，Chen Zhibao1
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Key Laboratory of Earth and Planetary Physics，Institute of Geology and Geophysics，Chinese Academy of Sciences）

A novel strain of magnetotactic bacterium was detected in Longfeng Wetland of Daqing City.It formed dozens of bulletshaped magnetite-type magnetosomes which were organized into single chain.Phylogenetic analysis of its 16S rRNA gene demonstrated that this strain was affiliated with the δ-Proteobacteria class within the Proteobacteria phylum.This study provided a case that magnetotactic bacteria occurred in wetland environments for the first time in the northeastern region of China.The first detection of magnetotactic δ-Proteobacteria indicated an abundant resources of magnetotactic bacteira in Daqing region，and also indicated the significance for the understanding of ecological environment in Longfeng wetland.

magnetotactic bacteria；δ-Proteobacteria；Longfeng wetland；16S rRNA；transmission electron microscopy

Q14

A

1002-2090（2017）05-0054-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.014

2017-03-06

国家自然科学基金（41522402和41374004）；黑龙江八一农垦大学研究生科研创新资助项目（YJSCX2016-Y46）。

张衡（1991-），男，黑龙江八一农垦大学2013级硕士研究生。

陈志宝，男，教授，博士研究生导师，E-mail：chenzhibao@byau.edu.cn。