真菌毒素快速检测技术

真菌毒素，又称霉菌毒素，是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害。真菌毒素可通过饮食进入人或动物体内，引起人或动物的急性或慢性中毒，进而损害机体，造成肝脏、肾脏及神经组织等的伤害。

真菌毒素主要包括黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮赭曲霉毒素等。1960年，英国10万多只火鸡因食用被黄曲霉毒素污染的饲料而死亡，此事件发生后，真菌毒素才逐渐引起人们的重视。受全球气候变暖、干旱等因素的影响，食用和饲用农产品受真菌毒素污染的现象日趋严重，世界各地对于真菌毒素污染的报道也日渐增多，玉米、小麦、大麦、花生等谷物以及干果、水果、中药材、牛奶等都容易被真菌毒素污染。因此，为减少霉菌污染，真菌毒素检测手段必不可少，本文全面介绍了真菌毒素的常规检测和快速检测方法。

真菌毒素的常规检测方法

液相色谱或液质联用法：高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和液相-质谱联用法（LC-MS/MS）具有分辨率高、准确性好、灵敏度高、检测限低等优点。目前，我国国家标准或行业标准中使用较多的也是高效液相色谱法，其中反相高效液相色谱法较为常用，其流动相主要为甲醇、乙腈和水或三者组成的混合溶液。HPLC可结合多种检测器，如紫外检测器（uv）、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）、质谱检测器（MS）以及电化学检测器（EC）等。

薄层色谱法：又叫薄层层析法（Thin Layer Chromatography，TLC），1968年AOAC首次提出利用微柱、薄层色谱法测定花生和花生制品中的黄曲霉毒素，此后许多国家也采用此法作为标准方法，它也是我国的标准方法。TLC根据真菌毒素能在紫外区域发出特殊荧光的特点来检测真菌毒素，样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩及TLC分离后，在特定波长紫外灯下照射，可观察到荧光。

气相色谱法：一种强大的分离技术，被广泛应用于各类物质的精确定量检测，但由于许多真菌毒素都是极性化合物，在进入气相色谱柱前需要采用一定的方式进行衍生，因而其在真菌毒素检测中的应用并不广泛，目前应用气相色谱法检测最多的真菌毒素是玉米赤霉烯酮。

真菌毒素的快速检测方法

快速检测真菌毒素一般采用免疫分析方法，此方法的理论基础为抗原抗体的特异性结合，主要包括放射免疫分析方法（RIA）、酶联免疫法（ELISA）和免疫层析法等。但因RIA需要使用同位素标记，有放射性污染，并且需要用到专门的仪器，故而，酶联免疫法（ELISA）和免疫层析法应用更为广泛。

酶联免疫技术：酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法（ELISA），是20世纪70年代发展起来的免疫检测技术，有直接法、间接法、双抗体夹心法等。虽然ELISA有多种模式，但基本原理和操作方法是相同的。首先将抗原或抗体固定到某种固相载体上（现在多为酶标板），并保持其免疫活性，然后将待测样品和酶标物（酶标抗体或酶标抗原）按不同步骤与固定的抗原或抗体进行反应，再然后将没有发生反应的物质洗去，最后加入酶的底物。底物在酶的催化下显色，最终通过显色程度进行定性或定量测定。ELISA可把抗原抗体免疫反应与酶的高效催化作用原理结合起来，因此具有选择性强、灵敏度高、时间短、检测限低等特点。

目前，市场上真菌毒素类酶联免疫检测试剂盒种类与规格繁多，样品前处理方法也较为多样化。北京普赞生物技术有限公司（以下简称“普赞生物”）自成立至今一直致力于真菌毒素快速检测方法的研究，目前已成功研制出黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、T2毒素、赭曲霉毒素等酶联免疫试剂盒。与其他同类产品相比，普赞生物的产品操作更为简便快速，40分钟左右即可完成样品检测并收集结果数据，回收率可达90%～110%，产品灵敏度和检测限均处于国内领先地位，尤其是黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒，灵敏度可达0.01ppb。

免疫层析法：免疫层析法（immunochromatography）是近年来国内外新兴的一种快速诊断技术，其原理是将特异抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，通过免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

目前，胶体金检测技术广泛应用于真菌毒素类物质的检测，其具有的低成本、操作简便、快速准确等特点已被用户及国家相关部门认可。组装成条的胶体金检测卡如图2所示，在一长条形的背板上按从左至右的顺序贴上样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜（NC膜）及吸水垫。NC膜上偶联有待测物的抗原（测试线，test line，T线）以及二抗（对照线，control line，C线），将抗体偶联纳米级的金颗粒放置在金标垫上。从样品垫处滴加样品，开始反应后，随着样品液的流动，偶联抗体的金颗粒流向抗原处，当抗原抗体结合使偶联的金颗粒聚焦到一定数量时，即可形成肉眼可见的红色条带。而当加样的液体中也含有待测物时，则固定在固相载体上的抗原与样品中的抗原竞争性结合待测物抗体，从而使NC上聚焦的金颗粒数目减少，进而使红色条带变浅直至无色。利用以上特性，可以在很短的时间内检测到ng/mL级的各种真菌毒素。

免疫学检测的基础是抗原抗体的特异性识别能力，这也是检测产品质量好坏的根本技术。普赞生物经过多年的不懈努力，不断筛选、合成和优化出各种真菌毒素类特异性抗原和抗体，并研制生产出相应的真菌毒素类检测卡，不仅具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简便等特点，而且无需任何仪器设备，结果判断直观可靠，适用于现场检测。其中，黄曲霉毒素B1和M1检测卡灵敏度可达到0.5ppb，赭曲霉毒素检测卡灵敏度为5ppb，呕吐毒素检测卡灵敏度为200ppb，玉米赤霉烯酮检测卡灵敏度为20ppb。

使用胶体金检测卡进行检测时，大部分时间都用在样品的前处理上，所以提高样品前处理效率可以在很大程度上缓解检测人员的压力并降低成本。以食用油样品为例，植物油容易受到黄曲霉毒素污染，其中又以花生油和玉米油更为严重，市场上黄曲霉毒素B1检测卡检测植物油时样品前处理流程一般为样品收集、提取液提取、氮吹、复溶、检测，完成整个流程一般需要0.5～1小时，并需配备氮吹仪，此外复杂的前处理往往会导致检测效果不理想。普赞生物针对这些问题研制出了食用油专用的黄曲霉毒素B1检测卡，无需吹干复溶等处理，每个样品处理只需2～5分钟，具有精确度高、前处理简单、检测所需时间短等优点。

展望

目前，国内外都有各类真菌毒素快速检测产品，从质量和技术上讲，国内公司生产的酶联免疫试剂盒和胶體金检测卡与进口产品的差距越来越小，甚至部分指标已经超越进口产品，畜牧相关行业和监管部门也已高度认可了这两类检测产品。虽然大部分用户的检测需求得到了基本满足，但是由于各类用户待测样品有所差异，所以检测效果和效率仍不能得到最大程度的保证，也就是说单独的检测卡、试剂盒产品还不能真正解决用户的检测问题，合适且具有针对性的定制化服务水平仍待提高。endprint