基于同工酶分析技术的山西关帝山三道川油松林种群分化研究

李帮同

基于同工酶分析技术的山西关帝山三道川油松林种群分化研究

李帮同

(山西省林业种苗管理总站，山西 太原 030801)

油松种子样品取于关帝山三道川油松天然林，主要收集地点为侯家沟、麻峪口、陈家庄、神堂沟、木口沟5个林分。采用同功酶分析技术，包括酶液制备、凝胶制备、电泳、染色等环节，分析了5个油松优良林分同功酶位点上的变异总量在林分间和群体内的分布情况。同时对林分变异做了基因多样度分析，GST值在位点间变动幅度较大，变化范围从0.006 0～0.070 9.7个位点上的GST平均值为0.049 8，即林分间的平均变异量仅占总群体的4.98%，而林分内的个体变异量占95.02%，揭示了三道川油松种群分化不明显，而个体分化显著的规律,为油松良种基地建设、修复和管理提供了科学依据。

山西省；油松林分；同功酶；GST值

从分子群体遗传学角度研究林木群体遗传变异，可直接度量群体内的遗传变异程度，且完全不受环境影响的干扰。从接近DNA水平上了解遗传变异，在目前可行的方法中，采用同功酶技术是最好的途径。采用同功酶技术研究种源变异的文献有很多，例如，Fins和Libby关于红杉(LarixpotaniniiBatalin)的研究，以及Nikolic和Tucic关于欧洲黑松(PinusnigraArn)的研究。在我国，已通过同功酶来研究林木遗传变异的树种有马尾松(Pinusmassoniana)、杉木[Cunninghamia lanceolata (Lamb.)Hook]、红松(Pinus koraiensis)、油松(Pinus tabulaeformisCarr.)等。

油松是我国特有的乡土树种之一，其在漫长的生长发育中存在着群体、个体上的性状差异，并且这种差异具有一定程度的遗传稳定性。笔者对山西关帝山三道川油松种群同功酶的性状差异及其遗传稳定性展开了初步探索，以期为今后油松林种群分化的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1材料收集

油松种子样品取于关帝山三道川油松天然林，主要收集地点为侯家沟、麻峪口、陈家庄、神堂沟、木口沟5个林分。每个林分选择10株优势木，优势木间距不小于50m，球果采自树冠中上部，东、南、西、北4个方向各采5个，每株共采20个。

1.2同功酶分析方法

1.2.1 酶液制备

取三道川5个油松林分每个群体、每个单株自由授粉的种子30粒，用水冲洗干净后，在25 ℃的温水中浸泡2d.然后置于湿润滤纸上，继续培养3d～5d.至种子露白时，剥取每粒种子的单倍体胚乳，放入指形管中，加入1mL样品提取液(pH值为7.6的磷酸缓冲液0.2mol)，在冰浴中研磨成匀浆。之后倒入离心管，再将1mL40%蔗糖溶液冲入离心管，冷冻离心10min(0 ℃，10 000r/min)后，取上清液，置于(0 ℃～ 4 ℃)冰箱内，贮存备用。

1.2.2 凝胶制备

分离胶的浓度是10%，用量为20mL;浓缩胶的浓度是4%，用量为5mL,按表1的比例制备。

表1 凝胶制备

1.2.3 电泳

采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法。5种酶的缓冲系统见表2.先用100 V电压预电泳1 h，后用250 V电压继续电泳3.0 h～3.5 h.待溴酚兰指示剂移至液面1 cm时，停止电泳，剥胶染色。

表2 缓冲系统

1.2.4 染色

草转氨酶(AAT)：称取0.073 g α-酮戊二酸，0.267 5 g天冬酸，1.0 g PVP，0.1 g EDTA和2.84 g Na2HPO4溶于H2O中，定容至200 mL，配制成AAT底物溶液。称取0.05 g固蓝BB溶于50 mL AAT底物溶液，即为染色液。将凝胶取出放入染色缸，倒入染色液，黑暗中37 ℃温育胶，直到呈现棕色的酶活性区带。

乙醇脱氢酶(ADH)：取NAD 15 mg，NBT 15 mg，PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)2.5 mg，0.2 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)缓冲液50 mL,混匀作为染色液。染色前加5 mL 95%乙醇作底物。电泳后剥下的凝胶板放在染色液中，37 ℃保温至显现深蓝色的条带时，倒掉染色液，用蒸馏水冲洗，拍照记录。

山梨醇脱氢酶(SDH)：称取150 mg山梨醇，溶于30 mL 0.2M的Tris-HCl(pH值8.0)，10 mg NAD，10 mg MTT和5 mg PMS溶于20 mL 0.2 M的Tris-HCl(pH值8.0)中，量取1.0 mL 1%的 MgCl2，将3种溶液混匀后即为染色液。取出凝胶放入染色缸，倒入染色液，黑暗中温育胶30 min～60 min，直到蓝带显示。

苹果酸酶(ME)：称取10 mg NADP，10 mg MTT和5 mg PMS溶解于10 mL 0.2 M的Tris-HCl(pH值8.0)，量取5 mL 1%的 MgCl2和25 ml 0.5 M的苹果酸(pH值7.0)，混入上述溶液，即为染色液。取出凝胶放入染色缸，倒入染色液，黑暗中温育胶，直到谱带显示。

苹果酸脱氢酶(MDH)：称取10 mg NAD，10 mg NBT和5 mg PMS溶解于25 mL 0.2 M的Tris-HCl(pH值8.0).量取25 mL 0.5 M的苹果酸(pH值7.0)，混入上述溶液，即为染色液。取出凝胶放入染色缸，倒入染色液，凝胶在黑暗中37 ℃温育胶2 h以上，直到酶带活性区带呈现深蓝色。

1.2.5 同功酶位点的确定和等位基因的命名

根据5种同功酶的酶谱绘制酶谱示意图。在表示同功酶位点和等位基因时，由酶的缩写字母代表酶系统，连字符后的数字代表不同的位点，距正极最近的位点为1，其它各位点依次用2，3，…表示。对同一位点，等位基因的确定根据谱带的迁移率，依次用A，B，C…表示。无活性或活性极弱的谱带用SA表示。

1.3分析方法

同功酶位点变异的度量指标：

1) 多态位点百分率(P)：同工酶测定为多态的位点占测定总位点数的百分比即位多态位点百分率。当群体中某位点有0.01以上频率的复等位基因共存时，该位点称为多态，否则为单态。

2) 等位基因平均数(A)：

式中：ai——第i个位点的等位基因数；

n——同功酶测定的位点总数。

3) 等位基因频率(fij)：

式中：Nij——基因的个数；

N——基因的总数。

4) 平均期望杂合度(He)：

式中：hei——第i个位点期望杂合度；

h——同功酶测定的位点总数。

5) 基因分化系数(GST)：

式中：Ht——总群体的基因多样度；

Hs——群体内基因多样度。

GST反映了群体间变异占总变异比值的大小，是度量群体分化的理想指标。

6) 遗传距离(D)：

其中，

式中：JX——在X群体随机选出的基因相同概率的平均数；

JY——在Y群体随机选出的基因相同概率的平均数；

JXY——在X，Y两个群体随机选出的两个基因相同概率的平均数；

fXij——X群体第i个位点第j个等位基因的频率；

fYij——Y群体第i个位点第j个等位基因的频率。

2 研究结果

2.1油松5个优良林分的形态变异分析

测定的5个油松优良林分分别为侯家沟林分、麻峪口林分、陈家庄林分、神堂沟林分、木口沟林分，其针叶长、球果长、球果宽、百粒重等性状特征值见表3.

表3 5个油松优良林分的性状特征值

从表3可以看出，5个油松优良林分针叶长的平均值为10.5 cm，变幅为7.3 cm～12.9 cm，变异系数为0.105 1.球果长平均值为5.3 cm，变幅为4.2 cm～6.6 cm，变异系数为0.101 8.球果宽平均值为3.6 cm，变幅为2.9 cm～4.4 cm，变异系数为0.089 2.百粒重平均值为4.8 g，变幅为3.3 g～6.4 g，变异系数为0.152 7.针叶和球果的变异系数明显小于百粒重的变异系数，说明百粒重受环境影响较大。

对5个油松优良林分针叶长、球果长、球果宽、百粒重的差异分别做了单因素方差分析，结果见表4.

表4 5个油松优良林分的性状方差分析

从表 4 可以看出，油松优良林分间各性状的差异均未达显著水平，说明 5 个油松优良林分性状表现是相对稳定的。

2.2油松优良林分同功酶分析

2.2.1 酶谱分析

5种同功酶的酶谱示意图见第17页图1至图5.

由图1至图5可以看出：

1) GOT在所有分析的单株中均有2个染色区，分别定名为Got-1和Got-2.Got-1有2种谱带表现形式，一种是最常见的慢带(等位基因A)，一种是快带(等位基因B)。Got-2有3种谱带表现形式。由于GOT重复性好，在林木研究中已有很多报道，不同树种在GOT的位点上存在差异。

2) ADH在分析的单株中有1个染色区，受1个位点控制，有3种谱带表现。

3) SDH在分析的单株中有1个染色区，受1个位点控制，有3种谱带表现。

4) MDH在分析的单株中有2个染色区，受2个位点(Mdh-1，Mdh-2)控制。其中,Mdh-1有3种谱带表现形式，Mdh-2有4种谱带表现形式。目前，大部分研究中报道，MDH受4个位点控制，但也有一部分报道显示其受2个或3个位点控制。

5) ME在所有的单株中均有一条清晰的谱带，属于1个染色区，受1个位点控制。该位点只有1个等位基因，属单态位点。

图1 GOT酶谱示意图 图2 ADH酶谱示意图

图3 SDH酶谱示意图 图4 MDH酶谱示意图

图5 ME酶谱示意图

2.2.2 油松优良林分基因异质水平

5个油松优良林分的等位基因频率及期望杂合度见表5.

表5给出了5个油松优良林分在7个位点的等位基因频率(fij)和期望杂合度(He)。有6个位点(Got-1，Got-2，Adh-1，Sdh-1，Mdh-1，Mdh-2)是多态的。被称为多态性的位点必须具有2个以上的等位基因。1个位点是单态的(Me-1)。5个林分各个位点的He平均值，按大小次序为Sdh-1(0.398)，Adh-1(0.251)，Mdh-1(0.238)，Mdh-2(0.223)，Got-1(0.197)，Got-2(0.126)和Me-1单态位点。He平均值在位点间变化范围较小，说明不同位点间不存在较大的异质性。

表5 5个油松优良林分的等位基因频率及期望杂合度

5个油松优良林分的遗传参数见表6.

表6 5个油松优良林分的遗传参数

由表6可见，多态位点百分率在5个油松优良林分间相同。林分平均期望杂合度(He)代表了林分内杂合体的比例,其在5个林分中的变化范围为0.153～0.251，平均为0.208.等位基因平均数直观反映了林分内等位基因的丰富度，其变化范围为2.00～2.43，群体间变异很小。可见，5个林分的3个遗传多态参数的均值较小，说明这5个林分在研究的酶位点上，变异水平较低。

2.2.3 油松优良林分间的遗传分化

为确定研究的5个油松优良林分同功酶位点上的变异总量在林分间和群体内的分布情况，对林分变异做基因多样度分析。遗传分化参数见表7.

表7 遗传分化参数

从表7中可以看出，GST值在位点间变动幅度较大，范围为0.006 0～0.070 9.7个位点上的GST平均值为0.049 8，即林分间的变异量平均占总群体的4.98%，而大多数的变异(95.02%)存在于林分内的个体。

2.2.4 油松优良林分遗传距离

为了进一步分析油松优良林分的相似程度，依据表5中的等位基因频率计算林分间的遗传距离，结果见表8.

表8 5个油松优良林分间的遗传距离

从表8中知，林分4与林分5遗传距离为0.991 3，林分1与林分4和林分5的遗传距离分别为0.986 4，0.990 5.5个林分的遗传距离变动范围较小，非常接近，说明这5个林分间的分化程度不高。

5个油松优良林分遗传距离系统图见图6.

从侯家沟、麻峪口、陈家庄、神堂沟、木口沟5个油松优良林分的表现性状和同功酶分析看出，5个油松林分间差异很小，是相对稳定的，具遗传稳定性。由此也可推断出，三道川优良种源的性状表现也具有遗传稳定性。然而，从遗传距离分化看，林分间的变异量平均占总群体的4.98%，大多数的变异(95.02%)存在于林分内的个体，说明个体差异还是很明显的。

图6 5个油松优良林分遗传距离系统图

3 结论和讨论

1) 通过同功酶分析油松天然优良林分的变异与稳定性，表明山西关帝山三道川5个油松优良林分间同功酶差异很小，具有遗传稳定性。这为研究油松优良生长性状的稳定性奠定了生化基础。从遗传距离分化看，林分间的变异量平均占总群体的4.98%，而大多数的变异(95.02%)存在于林分内的个体，体现出个体差异还是很明显的。

2) 建议继续开展油松育种领域的研究工作，特别是对其群体、个体同功酶的研究，对油松育种体系建设和良性循环的意义重大。

[1] 郭军战，毕春侠，李周岐.油松、巴山松天然群体GOT同工酶变异性分析[J].河北林果研究，1996(S1)：1-4.

[2] 张春晓，李 悦，陈雪梅.油松同工酶位点选择研究[J].北京林业大学学报，1990(1)：11-16.

[3] 张春晓，李 悦，沈熙环，等.油松10个天然与人工群体两个同工酶系统的遗传多样性研究//面向21世纪的中国生物多样性保护——第三届全国生物多样性保护与持续利用研讨会论文集.北京：中国林业出版社，1998.

[4] 李 毳.油松天然种群遗传多样性及系统地位分析.太原：山西大学，2008.

[5] 张存旭.巴山松天然群体酯酶同工酶遗传变异的初步分析[J].西北林学院学报，1991(2):89-92．

PopulationDifferentiationStudyonPinesTabulaeformisinSandaochuanofGuandiMountainBasedIsozymeAnalysisTechnique

LiBangtong

(ShanxiForestrySeedandSeedlingAdministrationCentralStation，Taiyuan030012，China)

The seed samples were taken from the naturalPinestabulaeformisforest in Sidaochuan of Guandi mountain.The main collection sites were located in Houjiagou,Mayukou,Chenjiazhuang,Shentanggou and Mukougou.The total Isozymes variation of 5 good standsPinestabulaeformisand their distribution in stands and between groups were analyzed by isozyme analysis technique which including enzyme liquid,gel preparation,electrophoresis,dyeing and other sections.Meanwhile,the genetic diversity of the stand variation was determined.The value of Glutathione S-transferase (GST) varied widely from 0.006 0 to 0.070 9,and the average value ofGSTat those 7 sites was 0.049 8.The average variation among stands was only 4.98% of the total population,while the proportion of individual variation was 95.02%.It revealed that the population differentiation was not obvious,but the individual differentiation was remarkable,which could provide scientific basis for the construction,repair and management ofPinestabulaeformisimproved variety base.

Shanxi province;Pinestabulaeformisforest; Isozyme; Value of Glutathione S-transferase

S791.254

A

1007-726X(2017)03-0014-05

2017-03-29

李帮同(1962— )，男，山西晋城人，1991年毕业于北京林业大学，高级工程师。