松针提取物的GC-MS分析及其复配剂对榆紫叶甲的毒杀效果

崔 义， 王海英， 胡佳艺， 方娇阳， 王婷婷

(东北林业大学 林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040)

·研究报告——生物质天然活性成分·

松针提取物的GC-MS分析及其复配剂对榆紫叶甲的毒杀效果

崔 义， 王海英*， 胡佳艺， 方娇阳， 王婷婷

(东北林业大学 林学院， 黑龙江 哈尔滨 150040)

采用索氏提取法以正己烷为溶剂从樟子松和黑皮油松新鲜针叶中提取松针提取物，对提取物进行了气相色谱-质谱(GC-MS)分析,并分别研究了这2种松针提取物与松木屑木醋液的复配剂对榆紫叶甲的杀虫活性。研究结果表明：樟子松鲜针叶正己烷提取物中共鉴定出16种成分，总GC含量为65.92 %，GC含量最高的化合物是2,2,4,4,6,8,8-七甲基壬烷(23.72 %)，其次是苯乙酸-3-己烯酯(8.56 %)。黑皮油松鲜针叶正己烷提取物中共鉴定出41种成分，总GC含量为98.06 %，GC含量最高的化合物是石竹烯(23.29 %)，其次是4-epi-荜澄茄油烯醇(11.24 %)。这2种松针提取物复配木醋液(体积比1∶9)的5倍蒸馏水稀释液，对榆紫叶甲成虫的毒杀效果差，樟子松鲜针叶提取物复配木醋液(体积比1∶9)的5倍蒸馏水稀释液对榆紫叶甲成虫的毒杀效果优于木醋液的5倍蒸馏水稀释液。实验1～4天，松木屑木醋液的5倍蒸馏水稀释液对榆紫叶甲幼虫的毒杀效果要好于黑皮油松鲜针叶提取物复配木醋液(体积比为1∶9)的5倍蒸馏水稀释液，第5天则相反。

樟子松；黑皮油松；索氏提取；松木屑木醋液；榆紫叶甲

樟子松(PinussylvestrisL. var.mongolicaLitv.)为欧洲赤松的变种，又名海拉尔松，产于黑龙江省大兴安岭海拔400～900 m的山地及内蒙古海拉尔以西、以南一带沙丘地区，蒙古也有分布，针叶2针一束、硬直、常扭曲、先端尖。黑皮油松(PinustabuliformisCarr. var.mukdensisUyeki)为油松的变种，产于沈阳北陵、鞍山千山、医巫阊山及河北承德，针叶2针一束、深绿色、粗硬[1]。松针是松科常绿乔木针叶的统称，从松针中可以提取具有独特芳香气味的天然香料[2]。植物提取物对昆虫有不同程度的拒食、驱避、抗生、抑制生长发育和直接毒杀作用[3]。木醋液是将植物原料炭化或干馏过程中产生的气体混合物经冷凝回收分离获得的有机产品[4]。木醋液具有抑菌[5-7]、抗氧化[8]、杀虫[6,9]等生物活性，在杀虫领域的应用具有潜在开发价值[10-12]。将木醋液与植物提取物复配可以用来制备杀虫剂等[13]。榆紫叶甲(AmbrostomaquadriimopressumMotschulsky)为昆虫纲、鞘翅目、叶甲科，又名榆紫金花虫，是榆树的主要害虫之一，可导致树木整株死亡，在东北地区严重危害榆树的生长，给经济和生态造成巨大损失[14]。本研究采用索氏提取法分别对樟子松和黑皮油松的鲜针叶进行提取，通过气相色谱-质谱(GC-MS)法分析松针提取物活性组分，并测定其与松木屑木醋液复配后对榆紫叶甲幼虫和成虫的毒杀效果，以期为研制新型杀虫剂提供参考。

1 实 验

1.1材料、试剂和仪器

樟子松(PinussylvestrisL. var. mongolica Litv.)鲜针叶、黑皮油松(PinustabuliformisCarr. var. mukdensis Uyeki)鲜针叶，均于2015年6月采自东北林业大学校园，采后置于冰箱冷藏备用；松木屑木醋液，2015年3月通过干馏釜干馏法制备得到粗品，静置，取上清液，备用。榆紫叶甲(AmbrostomaquadriimopressumMotschulsky)的幼虫和成虫，采自哈尔滨城市林业示范基地。正己烷，分析纯；甲醇，色谱纯。

7890A-7000B型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.2松针提取物的制备

采用索氏提取装置以正己烷为溶剂分别提取樟子松和黑皮油松鲜针叶。取6月采集的樟子松鲜针叶20.02 g，剪成2～3 cm的小段，用滤纸小心包好并用细线扎紧后放入索氏提取装置的滤筒内，向滤筒内加入100 mL正己烷溶剂，将样品完全浸没，于85 ℃水浴提取4 h。将得到的混合物转移到分液漏斗中，静置，弃去水相。然后采用旋转薄膜蒸发法除去有机相中的正己烷溶剂，得到樟子松鲜针叶正己烷提取物。用同样的方法得到黑皮油松鲜针叶正己烷提取物。最后称所得提取物质量，计算得率。

1.3松针提取物的GC-MS分析

用甲醇分别将樟子松和黑皮油松鲜针叶正己烷提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪对试样进行分析。

色谱分析条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID检测器；初始温度40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的升温速率升到280 ℃，保持2 min；进样口温度250 ℃；进样量1.0 μL；不分流，氦气载气，流速1 mL/min。

质谱分析条件：EI电离源，接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描范围为30～500 u。

1.4木醋液的杀虫活性实验

根据参考文献[15～16]，采用喷雾法进行杀虫活性实验。模拟田间农药喷雾处理，以蒸馏水稀释得到体积分数分别为100 %、80 %、60 %、40 %、20 %的松木屑木醋液水溶液，并以蒸馏水作为对照。分别将各处理溶液及蒸馏水移入到小型按压喷雾瓶中。将直径3.5 cm的滤纸片放于养虫瓶底，用镊子轻挑入生理状态一致的10只榆紫叶甲成虫于养虫瓶内，喷雾瓶垂直于养虫瓶以最大喷雾量向瓶内喷入1 mL处理液，使滤纸浸湿并保证每条试虫身上都接触到雾滴，放入叶片大小均匀新鲜的榆树叶后，盖上瓶盖，于室温下培养。处理后每隔12 h观察并记录活虫数，轻轻触动观察试虫情况，以完全不动为死亡标准，观察记录时间为3 d。3次重复，按下式计算死亡率(%)。

死亡率=死亡虫数/处理总虫数×100 %

1.5樟子松和黑皮油松鲜针叶提取物复配木醋液的杀虫活性实验

1.5.1榆紫叶甲成虫的杀虫活性实验 根据参考文献[15～16]，采用喷雾法进行杀虫活性实验。设置 3个样品，分别为：松木屑木醋液、樟子松鲜针叶提取物和松木屑木醋液复配液(体积比为1∶9)、黑皮油松鲜针叶提取物和松木屑木醋液复配液(体积比为1∶9)。取适量上述样品均以蒸馏水稀释至原体积的5倍，以蒸馏水作为对照，按1.4节方法做杀虫活性实验。间隔时间为24 h，观察记录时间为12 d。

1.5.2榆紫叶甲幼虫的杀虫活性实验 设置2个样品，分别为：松木屑木醋液、黑皮油松鲜针叶提取物和松木屑木醋液复配液(体积比为1∶9)，操作同1.5.1，观察记录时间为5 d。

1.6数据处理

采用SPSS19.0、Excel 2007等软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1松针提取物的成分分析

2.1.1樟子松鲜针叶提取物的GC-MS分析 采用索氏提取法以正己烷为溶剂提取得到的樟子松鲜针叶提取物为淡黄色透明液体，得率为2.05 %。樟子松鲜针叶提取物样品的总离子流色谱图如图1所示，共鉴定出16种化合物，总GC含量为65.92 %，通过面积归一化法计算出各组分的GC含量，分析结果如表1所示。

图1 樟子松鲜针叶提取物的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current chromatogram of fresh needle leaves extracts of Pinus sylvestris var. mongolica

从表1可知，樟子松鲜针叶提取物主要由烷烃类(23.72 %)、醇类(16.9 %)、酯类(8.9 %)、醛类(4.65 %)、噻烷类(3.92 %)、酸类(2.3 %)、芳烃类(2.24 %)、酮类(1.67 %)、酚类(1.23 %)、呋喃核糖类(0.39 %)等化合物组成。GC含量最高的化合物是2,2,4,4,6,8,8-七甲基壬烷(23.72 %)，其次是苯乙酸-3-己烯酯(8.56 %)。

表1 樟子松鲜针叶提取物的GC-MS分析

2.1.2黑皮油松鲜针叶提取物的GC-MS分析 采用索氏提取法以正己烷为溶剂提取得到的黑皮油松鲜针叶提取物为淡黄色透明液体，得率为5.28 %。黑皮油松鲜针叶提取物样品的总离子流色谱图如图2所示，共鉴定出41种化合物，总GC含量为98.06 %，通过面积归一化法计算出各组分的GC含量，分析结果如表2所示。

图2 黑皮油松鲜针叶提取物的总离子流色谱图Fig. 2 Total ion current chromatogram of fresh needle leaves extracts of Pinus tabuliformis var. mukdensis

从表2可知，黑皮油松鲜针叶提取物主要由萜烯类(61.14 %)、醇类(12.24 %)、酯类(11.39 %)、酸类(8.27 %)、烷烃类(4.2 %)、酮类(0.28 %)、醚类(0.24 %)、噻吩类(0.16 %)、罂粟林类(0.14 %)等化合物组成。GC含量最高的化合物是石竹烯(23.29 %)，其次是4-epi-荜澄茄油烯醇(11.24 %)。

表2 黑皮油松鲜针叶提取物的GC-MS分析

续表2

序号No.保留时间/minretentiontime化合物名称compoundname分子式molecularformulaGC含量/%GCcontent匹配度/%matchingdegree3521.5311,1,6-三甲基-3-亚甲基-2-(3,6,9,13-四甲基-6-二亚甲基-10,14-二亚甲基-4-十五烯基)-环己烷1,1,6-trimethyl-3-methylene-2-(3,6,9,13-tetramethyl-6-ethyene-10,14-dimethylene-4-pentadecenyl)-cyclohexaneC33H561.1582.493622.4075-(7a-异丙烯基-4,5-二甲基-八氢化-4-茚基)-3-甲基-2-戊烯-1-醇5-(7a-isopropenyl-4,5-dimethyl-octahydro-4-indenyl)-3-methyl-2-penten-1-olC20H34O0.1877.333723.140(5α)-3-乙基-3-羟基-雄甾烷-17-酮(5α)-3-ethyl-3-hydroxy-androstan-17-oneC21H34O20.1277.323824.1041,2,3,4-四氢-3-O-甲基-罂粟林1,2,3,4-tetrahydro-3-O-methyl-papaverolineC17H19NO40.1469.013924.5575-叔丁基-3-(4-氯苄基二烯胺)-2-腈-噻吩5-tert-butyl-3-(4-chlorobenzylidenamino)-2-carbonitrile-thiopheneC16H15ClN2S0.1664.874024.862雄甾-4-烯-9,11-环氧-3,17-二酮androst-4-en-9,11-epoxy-3,17-dioneC19H24O30.1670.854125.204二氢贝壳杉酸dihydroagathicacidC20H32O47.9776.72

2.2杀虫活性分析

2.2.1木醋液的杀虫活性分析 木醋液的杀虫活性实验结果如表3所示。从表3可以看出，随着木醋液体积分数的增加，榆紫叶甲成虫的死亡率也逐步增加，表明木醋液的体积分数越大，对榆紫叶甲成虫的毒杀效果越好。体积分数60 %、80 %、100 %松木屑木醋液处理24 h，榆紫叶甲成虫的死亡率均超过50 %。

表3 木醋液的杀虫活性实验结果(成虫)

2.2.2松针提取物与木醋液复配的杀虫活性分析 木醋液及其复配2种松针提取物对榆紫叶甲成虫的杀虫活性结果如表4所示。从表4可以看出，各样品的致死率均未超过50 %，说明松针提取物与木醋液按体积比1∶9复配的5倍蒸馏水稀释液对榆紫叶甲成虫的毒杀效果差，原因可能为榆紫叶甲成虫的耐药性较强，药液稀释后浓度过低而没有发挥药效等。樟子松鲜针叶提取物和松木屑木醋液复配液(体积比为1∶9)稀释液的杀虫死亡率高于松木屑木醋液稀释液的杀虫死亡率，说明松木屑木醋液复配樟子松鲜针叶提取物有一定的杀虫增效作用。黑皮油松鲜针叶提取物和松木屑木醋液按体积比1∶9复配液稀释液对榆紫叶甲成虫的杀虫效果与松木屑木醋液稀释液相比较差别不大，前5天前者的死亡率甚至小于后者，原因可能是黑皮油松鲜针叶提取物与木醋液的复配液对榆紫叶甲虫的毒杀效果起效缓慢，到第6天成虫死亡率才开始升高。

表4 木醋液及其复配松针提取物的杀虫活性实验结果(成虫)

木醋液及其复配黑皮油松鲜针叶提取物对榆紫叶甲幼虫的杀虫活性结果如表5所示，由于提取到的樟子松鲜针叶提取物得率较低，产量较少，因此不做幼虫的杀虫实验。从表5可以看出，木醋液稀释液前4天的死亡率均高于黑皮油松鲜针叶提取物和松木屑木醋液按体积比1∶9复配液的稀释液，说明松木屑木醋液稀释液对榆紫叶甲幼虫的毒杀效果要好于黑皮油松鲜针叶提取物复配松木屑木醋液(体积比为1∶9)的稀释液，且松木屑木醋液稀释液和黑皮油松鲜针叶提取物与木醋液复配液稀释液之间差异显著，具有统计学意义。第5天，黑皮油松鲜针叶提取物和木醋液按体积比1∶9的复配液稀释液的幼虫死亡率高于松木屑木醋液，原因可能为松针提取物与木醋液复配起到增效作用。黑皮油松鲜针叶提取物提取量较少，其中的某些物质与木醋液复配后起效较慢，故前4天黑皮油松鲜针叶提取物和木醋液复配组的死亡率要低于木醋液处理组，直到第5天复配组才表现出增效作用。且由表4也可以看出黑皮油松鲜针叶提取物与木醋液复配液对榆紫叶甲成虫的毒杀效果起效相对木醋液处理组慢，二者表现一致。

表5 木醋液及其复配松针提取物的杀虫活性实验结果(幼虫)

1)同行不同小写字母、同列不同大写字母表示差异显著(P<0.05)different lowercase letters in the same line, different capital letters in the same column indicate significant difference(P<0.05)

3 结 论

3.1采用索氏提取法以正己烷为溶剂分别提取得到樟子松和黑皮油松鲜针叶提取物，并对其进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析。研究结果表明：樟子松鲜针叶提取物中共鉴定出16种化合物，总GC含量为65.92 %，GC含量最高的化合物是2,2,4,4,6,8,8-七甲基壬烷(23.72 %)，其次是苯乙酸-3-己烯酯(8.56 %)。黑皮油松鲜针叶提取物中共鉴定出41种化合物，总GC含量为98.06 %，GC含量最高的化合物是石竹烯(23.29 %)，其次是4-epi-荜澄茄油烯醇(11.24 %)。

3.2采用喷雾法研究了樟子松和黑皮油松鲜针叶提取物与木醋液复配对榆紫叶甲成虫和幼虫的毒杀效果。研究结果表明樟子松或黑皮油松鲜针叶提取物复配木醋液(体积比1∶9)的5倍蒸馏水稀释液对榆紫叶甲成虫的毒杀效果差。樟子松鲜针叶提取物和松木屑木醋液复配溶液(体积比为1∶9)稀释液的杀虫死亡率高于松木屑木醋液稀释液的杀虫死亡率，松木屑木醋液复配樟子松鲜针叶提取物，有一定的增效作用。实验第1～4天松木屑木醋液稀释液对榆紫叶甲幼虫的毒杀效果要好于黑皮油松鲜针叶精油复配木醋液(体积比为1∶9)稀释液，第5天则相反。黑皮油松鲜针叶提取物复配木醋液的稀释液对榆紫叶甲幼虫的杀虫效果起效慢。

[1]《中国植物志》编写委员会. 中国植物志[M]. 北京:科学出版社,1978:245,253.

[2]杨军衡. 松针资源开发利用探讨[J]. 经济林研究,2001,19(3):47>-48.

[3]江志利. 植物精油杀虫作用及制剂研究[D]. 杨凌:西北农林科技大学博士学位论文，2013.

[4]平安. 木醋液在农业上的应用及作用机理研究[D]. 哈尔滨:东北林业大学博士学位论文，2010.

[5]YATAGAI M,NISHIMOTO M,HORI K,et al. Termiticidal activity of wood vinegar, its components and their homologues[J]. Journal of Wood Science,2002,48(4):338>-342.

[6]ORAMAHI H A,YOSHIMURA T. Antifungal and antitermitic activities of wood vinegar fromVitexpubescensVahl[J]. Journal of Wood Science,2013,59(4):344>-350.

[7]段晓玲,王海英,刘志明,等. 农林废弃物干馏产物木醋液的抑菌活性[J]. 西南农业学报,2016,29(2):425>-429.

[8]段晓玲,王海英,刘志明,等. 木醋液体外抗氧化活性评价[J]. 生物质化学工程,2015,49(6):22>-26.

[9]冯晨,王海英,刘志明,等. 松木屑木醋液对舞毒蛾幼虫的毒杀活性[J]. 西南农业学报,2016,29(11):2604>-2608.

[10]崔义,王海英,方娇阳,等. 木醋液及其复配精油的杀虫活性分析[J]. 广东化工,2016,43(6):24>-25.

[11]王海英,杨国亭,刘志明. 柞树木醋液酚类物质的组分分析[J]. 林产化学与工业,2005,25(S1):143>-145.

[12]卢辛成,蒋剑春,孙康,等. 木醋液的制备、精制与应用研究进展[J]. 林产化学与工业,2017,37(3):21>-30.

[13]马承慧,杨国亭,刘牧,等. 植物源杀虫剂及其木醋液混合液对油松毛虫的防治效果[J]. 东北林业大学学报，2008，36(3):76>-77.

[14]李婷,张晓军,张健,等. 我国榆紫叶甲防治的研究进展[J]. 北方园艺,2015(22):195>-198.

[15]农业部农药检定所. 中华人民共和国农业行业标准NY/T1154.9—2008农药室内生物测定试验准则杀虫剂第9部分:喷雾法[S]. 北京:中华人民共和国农业部,2008.

[16]崔义,王海英,胡佳艺,等. 落叶松鲜针叶精油的化学成分及杀虫活性研究[J]. 生物质化学工程,2016,50(3):35>-40.

GC-MS Analysis of Pine Needles Extracts and Toxic Effect of Their Complex Agent on Ambrostoma quadriimopressum Motschulsky

CUI Yi, WANG Haiying, HU Jiayi, FANG Jiaoyang, WANG Tingting

(College of Forestry,Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Fresh needle leaves extracts ofPinussylvestrisL. var. mongolica Litv.andPinustabuliformisCarr. var. mukdensis Uyeki were respectively obtained by Soxhlet extraction method with hexane as solvent and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). The insecticidal activities of the extracts of the two needle leaves mixed pine sawdust wood vinegar onAmbrostomaquadriimopressumimago and larvae were studied separately.The results showed that 16 components were identificated from the extracts ofPinussylvestrisL. var. mongolica Litv. and the highest GC content compound was 2,2,4,4,6,8,8-heptamethyl-nonane(23.72 %),followed by phenyl-acetic acid-3-hexenyl ester(8.56 %).41 components were identificated from extracts ofPinustabuliformisCarr. var. mukdensis Uyeki, and the highest GC content compound was caryophyllene(23.29 %), followed by 4-epi-cubedol(11.24 %). The insecticidal effects of five times diluted mixture of extracts of the two needle leaves and wood vinegar(volume ratio 1∶9) onAmbrostomaquadriimopressumimago were poor, and the insecticidal effect of five times diluted mixture of extracts of needle leaves ofPinustabuliformisCarr. var. mukdensis Uyeki and wood vinegar(volume ratio 1∶9) onAmbrostomaquadriimopressumimago was better than that of wood vinegar. In the first four days, the insecticidal effect of five times diluted wood vinegar onAmbrostomaquadriimopressumlarvae was better than the five times diluted mixture of extracts ofPinustabuliformisCarr. var. mukdensis Uyeki fresh needle leaves and wood vinegar(volume ratio 1∶9),the results were opposite on the fifth day.

PinussylvestrisL. var. mongolica Litv.;PinustabuliformisCarr. var. mukdensis Uyeki;Soxhlet extraction;wood vinegar;AmbrostomaquadriimopressumMotschulsky

TQ35;TQ651

A

1673-5854(2017)05-0007-08

10.3969/j.issn.1673-5854.2017.05.002

2016- 07- 20

黑龙江省自然科学基金项目(C201411)；省级大学生创新训练项目(201510225128)

崔 义(1993— )，男，山西忻州人，本科生，主要从事植物资源开发利用研究

*通讯作者：王海英，副教授，硕士生导师，博士，主要从事植物资源化学以及木醋液、精油、纤维素等植物资源开发利用研究；E-mail: haiyingwang908@126.com。