RPMI—1640培养基和DMEM培养基中HepG—2细胞生长状况

张迪夏 薇芦瑶

【摘要】目的：比较含12%新生牛血清的RPMI-1640培养基与含12%新生牛血清的DMEM培养基培养HepG-2细胞的效果。方法：采用舍12%新生牛血清的RPMI-1640培养基与含12%新生牛血清的DMEM培养基培养HepG-2细胞，观察细胞的生长状态，细胞的贴壁情况，并进行细胞计数。结果：含12%新生牛血清的RPMI-1640培养基中的细胞生长状态更好，细胞的存活率更高。结论：在对HepG-2细胞进行细胞培养时建议首选含12%新生牛血清的RPMI-1640。

【关键词】DMEM； HepG-2；RPMI-1640

当前大部分学者在对贴壁细胞进行细胞培养时通常选用PRMI-1640培养液或DMEM培养液，故在对HeoG-2细胞进行细胞培养时也可应用PRMI-1640培养液或DMEM培养液。但已有研究发现[1]：由于PRMI-1640培养基和DMEM培养基中各成分不同，尤其是氨基酸，维生素和葡萄糖的含量差别很大，因此对细胞的生长速度和生长状态产生一定影响。在体外细胞培养的过程中，细胞生长状态的好坏和细胞生长速度的快慢等方面与细胞培养基的选择有着密不可分的联系。已有研究表明：在细胞培养基的制备过程中，需要在培养基中添加一定含量的生物性液体或组织提取液才能支持细胞的正常生长，由于血清中含有天然促生长因子，可以促进细胞贴壁，因此成为被广泛采用的培养基添加物，最常用的为新生牛血清[2]。赵翔[3]等人在研究PRMI-1640和DMEM培养基中对Hep G2的影响时并没有充分考虑到血清浓度对于HepG-2细胞的影响，选用的为浓度为10%新生牛血清并且没有加入一定量的双抗。但已有研究表明由于人肝癌细胞株生长缓慢，恶性程度较高，因此对于血清的要求比较严格，其培养时所需要新生牛血清的浓度要比一般的肿瘤细胞高一些。因此本实验应用PRMI-1640和DMEM培养基加入12%新生牛血清和0.5%的双抗对Hep G2人肝母细胞瘤进行培养。希望为选择适合于Hep G2细胞培养的培养基的选择提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

（1）HepG-2细胞株由北华大学提供；

（2） RPMI-1640和DMEM培养基均购自美国GIBCO公司；

（3）新生牛血清购于杭州四季青公司。

1.2方法

1.2.1细胞复苏

从液氮箱中取出冻存管，快速转移至细胞间，放入37摄氏度恒温水浴箱中进行均匀摇晃，尽量让细胞在1分钟内解冻。解冻后使用含75%的酒精喷洒冻存管的管口和管身对冻存管进行消毒。消毒后转移至超净工作台内进行复苏。将冻存管内液体转移至15ml离心管内，700转/min进行离心，离心后，吸去上清。

1.2.2培养基的选择

方法一：1640培养液

取1640培养粉215.6g和碳酸氢钠39溶解于1170ml高压灭菌的双蒸水当中，用磁力搅拌器搅拌至其完全溶解，用1mol/1NaCl将PH调至7.2，定容至1.5L，过滤除菌后4摄氏度进行保存。吸去上清后加入30ml含12%新生牛血清和0.5双抗的1640培养基，用移液枪小心吹打细胞混匀后加入细胞培养板，每孔5ml，共6孔，放入5%CO₂，温箱37℃进行培养。

方法二：DMEM培养液

取DMEM培养粉20.1g溶解于1200ml高压灭菌的双蒸水当中，用磁力搅拌器搅拌至其完全溶解，向溶液中加入碳酸氢二钠5.55g，继续搅拌至其完全溶解，用1mol/l氯化钠将PH调至7.2，混合均匀后，定容至1.5L，过滤除菌后4摄氏度进行保存。吸去上清后加入30ml含12%新生牛血清和0.5%双抗的DMEM培养基，用移液枪小心吹打细胞混匀后加入细胞培养板，每孔5ml，共6孔，放入5%CO₂，温箱37℃进行培养。

1.2.3细胞换液

取出培养箱中的细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态。吸弃废液，用PBS进行洗涤三次，再用细胞液进行洗涤1次，两组各加入含有12%的新生牛血清的1640培养液和DMEM培养液。

1.2.4细胞传代

待细胞贴壁情况达至80-90%时并且细胞生长状态良好时可以进行细胞传代培养。小心吸弃废液，用PBS进行洗涤三次，再用细胞培养液进行洗涤一次。加入0.25%胰酶进行消化，放入培养箱中每隔2min进行镜下观察一次，待细胞变圆后可轻轻拍打培养盘，待贴壁细胞大部分下来后，加入细胞培养液终止消化，用尖吸头吹打细胞并转移至离心管中，700转/min离心5min，小心吸弃废液，加入一定量的细胞培养液进行吹打混匀，大约吹打50-100次后转移至培养皿中。

1.2.5细胞形态观察

各组细胞分别培养12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h后在倒置显微镜下进行观察，觀察细胞贴壁情况，细胞的生长程度，有无细胞碎片或死细胞。

1.2.6细胞计数

酒精棉球擦盖玻片，将其放在计数板的槽上。将PBS与台盼兰按照1：1组成混合液。取9ul细胞悬液和9ul混合液混合均匀于1.5ml离心管中，盖上盖玻片，取12ul混合液自血球计数盘上方加入，于10倍显微镜下进行观察，活细胞不着色，着色呈蓝色的为死细胞。分别计数落在计数盘上四个大方格上的细胞数量，将4个大方格上数量相加得到细胞的总数量，除以4，乘以稀释倍数，最后乘以10000，即为每毫升细胞悬液中细胞数。

2结果

2.1细胞形态

RPMI-1640与DMEM培养液（含12%新生牛血清）培养细胞24h后，两组细胞均部分贴壁，生长状态良好，上层有少许未贴壁的细胞，并没有特别大的差别。在细胞培养48h后，在RPMI-1640培养液中的细胞饱满、细胞呈堆积生长，单个细胞形态不明显。细胞堆积后呈梭形或多边形，多数细胞呈分裂状态。培养60h后RPMI-1640培养液中细胞状态尚可，72h后出现少许黑色颗粒疑似死细胞，细胞液开始出现浑浊现象。但贴壁情况和其他细胞生长状态良好，84h开始出现死细胞。培养48h后，DMEM培养液中开始出现黑色颗粒疑似死细胞，细胞也呈堆积生长，但堆积的贴壁细胞中有圆圆的透明颗粒，细胞液开始出现浑浊现象。72h后DMEM培养液中出现明显死细胞，细胞状态稍差。

2.2细胞数量

RPMI-1640与DMEM完全培养液（含12%新生牛血清）培养细胞生长情况以培养时间为横座标，以细胞量（×10000）为纵座标进行绘图，见图1。

3讨论

原发性肝癌具有发病率高和死亡率高等特点，其中50%发生在我国，由于治疗困难，因此死亡率也一直居高不下，严重威胁到了我国人民群众的生活和健康，因此对其研究势在必行。

细胞在体外得以生长、增殖需要大量的营养物质和氨基酸，因此培养基的选择是体外细胞培养能否成功的关键因素之一。RPMI-1640细胞培养基是由Moore等人于1967年研制，含21种氨基酸和维生素11种等。DMEM是由Dulbecco改良的Eagle培养基，DMEM含有14种氨基酸和多种维生素。其中葡萄糖含量为4500mg/L。

从细胞培养的情况来看，在含有12新生牛血清和0.5双抗的DMEM培养液中HepG-2细胞在48 h内细胞长势良好贴壁状态良好，但48h后细胞开始出现死亡现象。在含有12新生牛血清和0.5双抗的RPMI-1640培养液中HepG-2细胞24h后的贴壁情况和细胞数量明显优于DMEM培养液中的细胞，并且出现死亡细胞的时间明显长于DMEM培养液中的细胞。

由于DMEM中含有大量的葡萄糖，RPMI-1640含有大量的氨基酸和维生素，而氨基酸和维生素种类更多的培养液更有益于细胞生长，而由于肿瘤细胞恶性程度比较高，因此选用血清浓度较高的RPMI-1640培养液更有助于HepG-2细胞的生长。

参考文献

[1]Zhong ZH， Yang H，Liu YH.Hunan YixueGaodengZhuankeXuexiaoXuebao，2003，5（04）：7-8.钟志宏，楊昊，柳永和.Hep G-2细胞体外培养条件优化[J].湖南医学高等专科学校学报，2003，5（04）：7-8.

[2]唐莹，冯君.动物细胞培养基的发展及应用[J].中国临床康复，2006（41）：146-148.

[3]赵翔，张沙，肖军军，林明.RPMI-1640和DMEM培养基中肝癌细胞系BEL-7402与HepG-2的生长状态比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2011， 15（11）： 2002-2005.