蛋白电泳在小麦种子真实性及纯度鉴定中的应用

杨萧帆

[摘 要] 小麦种子的真实性与纯度是小麦种子质量的一个重要衡量指标。准确鉴定小麦种子的真实性与纯度，对于提高农作物的产量与品质等具有重大意义。目前存在几大类不同的测定方法：传统鉴定法、生物化学方法及分子生物学方法。本文主要基于过往各种小麦种子纯度鉴定的基础，利用SDS-PAGE凝胶蛋白电泳来鉴定小麦种子的纯度。通过对烟农、宁麦、江麦、济麦4个品种的小麦各取100单粒进行蛋白凝胶电泳，将得到的胶带进行差异性分析，得到4个品种小麦的纯度鉴定结果。

[关键词] 小麦种子；SDS-PAGE；纯度；真实性

[中图分类号] S512.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-7909（2017）21-63-4

种子纯度及真实性是评价小麦种子质量的重要指标之一，国家标准规定小麦良种的纯度应达到99%[1]。种子纯度、净度、发芽率和水分是衡量种子质量的重要指标，4项指标中纯度是非常重要的，直接影响农作物的产量和农民的收入[2]。因此，种子纯度检测工作是非常重要的。种子纯度是指品种典型一致性的称度，即样品中待测品种种子数或株数占供检样品种子总粒数或总株数的百分比，是体现种子质量的重要指标之一，是种子分级和评定种子质量优良程度的基本依据[3]。在生产上，种子纯度检测能防止种子混杂退化，提高种子品质，并能延长良种的使用年限，充分发挥良种种性。

目前存在几大类不同的测定方法：传统鉴定方法（如幼苗形态鉴定、组织化学鉴定、田间小区种植鉴定[4]）、生物化学方法及分子生物学方法。各种方法都有各自的局限性，如组织化学法是凭借苯酚和氢氧化钠與种子各组织发生的颜色反应，根据种子间颖果和种皮着色差异区别杂株的种子，而小麦品种之间种子组织对染料的反应差异不大，很难以此鉴定种子纯度[5]。

鉴于这种状况，采用分子标记检测种子纯度的研究在小麦[6]、水稻[7]等各种作物上陆续开展。例如，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（SDS-PAGE）对10个玉米品种进行醇溶蛋白遗传多样性分析[8]。

小麦种子中含有各种贮藏蛋白，不同品种所特有的蛋白组成能反映出该品种的基因组成[9]，且有不同的遗传特性，能够得到其清晰、稳定、准确的电泳图谱，对鉴别种子真实性及纯度十分重要[10]。因此，可以利用SDS-PAGE凝胶电泳来分离和鉴定蛋白质。另外，可以根据迁移率大小测定某些蛋白质的分子量。通过获得的蛋白质谱带可以测定小麦种子的纯度，并鉴定小麦种子的真实性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料。济麦22、江麦919、烟农19、宁麦14，均由中江种业提供。

1.1.2 仪器。电泳仪、摇床、离心机。

1.1.3 试剂。30%单体贮备液，4×分离胶缓冲液，4×浓缩胶缓冲液，10%过硫酸铵，10% TEMED，蛋白提取液，4×样品缓冲液，电极缓冲液，固定液，G250染色液，R250染色液，快速脱色液，慢速脱色液，12.5%SDS-PAGE分离胶，5%DSD-PAGE浓缩胶。

1.2 试验步骤

1.2.1 蛋白的提取。取济麦、宁麦、江麦、烟农4个品种的小麦种子单粒各100粒，将单粒磨碎成粉末状，待用。将取得的单粒样品置于1.5 mL离心管中，加入1.0 mL蛋白提取液，置于37 ℃的摇床中震荡1 h。

1.2.2 样品离心。将样品置于4 ℃、1.2万rpm的离心机中离心15 min，取上清液。

1.2.3 样品获取。取60 μL相同浓度的样品按4∶1比例加入样品缓冲液。将样品充分涡旋混匀并煮沸3～5 min待用。

1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续垂直凝胶电泳，凝胶厚度1 mm，浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12.5%。组装凝胶模具，按照说明书组装好灌胶模具。对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前必须确保凝胶玻璃板和底部胶条紧密接触，防止细微不匹配导致凝胶泄露。

1.3 数据分析

根据电泳结果计算出每个品种谱带的Rf值[11]，用0、1表示电泳谱带的有无，在相同Rf值位置上有蛋白质谱带的记为1，无带记为0。

2 结果与分析

2.1 小麦种子总蛋白凝胶图谱分析

根据所获得的凝胶图谱得到如图1所示的4个品种小麦种子的蛋白差异比较，整理出结果如表1所示。可见，总蛋白在不同品种间存在差异。所有供试品种的总蛋白共表现出40条谱带，26条具有多态性。以图1中最后一条谱带的迁移率为1.00。江麦919与济麦22之间共有18条共同谱带，特征带Rf值为：0.22，0.26，0.29，0.38，0.41，0.45，0.49，0.65，0.80。江麥919与宁麦14之间共有14条共同谱带，特征带Rf值为：0.10，0.12，0.13，0.16，0.25，0.26，0.35，0.38，0.49，0.58，0.65，0.75，0.80，0.84，0.94。江麦919与烟农19之间共有22条共同谱带，特征带Rf值为：0.01，0.03，0.06，0.16，0.22，0.38，0.42，0.49，0.58，0.65，0.68，0.72，0.75，0.80，0.90，0.94。济麦22与宁麦14之间共有17条共同谱带，特征带Rf值为：0.10，0.12，0.13，0.16，0.22，0.25，0.29，0.35，0.41，0.45，0.58，0.75，0.84，0.94。济麦22与烟农19之间共有23条共同谱带，特征值Rf为：0.01，0.03，0.06，0.16，0.26，0.29，0.41，0.42，0.45，0.58，0.68，0.72，0.75，0.90，0.94。宁麦14与烟农19之间共有25条共同谱带，特征带Rf值为：0.01，0.03，0.06，0.10，0.12，0.13，0.22，0.25，0.26，0.35，0.42，0.68，0.72，0.84，0.90。

由此可见，不同品种小麦之间的谱带均存在差异。在SDS-PAGE系统中，谷蛋白谱带丰富，谱带的多态性较强，特征带也较多。

图1 各品种小麦种子电泳图像

注：1、2、3、4依次为江麦919、济麦22、宁麦14、烟农19。

2.2 小麦种子纯度鉴定

种子纯度是种子质量的主要指标。种子纯度的降低会明显降低作物的产量和产品品质[12]。从图2可以看出，济麦22的种子图谱显示出了较好的一致性，有些条带较浅，可能是染色不均匀的原因，因此这批种子中无异种子。从图3可以看出，22号种子在Rf值0.12处有明显缺失，应为异种子。

图2 济麦部分种子蛋白SDS-PAGE电泳纯度图谱

图3 烟农部分种子蛋白SDS-PAGE电泳纯度图谱

按上述方法利用Rf值对4个品种的小麦种子进行分析，最后得到江麦919的种子纯度为99%，济麦22的种子纯度为99%，宁麦14的种子纯度为98%，烟农19的种子纯度为98%。

2.3 小麦种子真实性鉴定

种子的真实性是指一批种子所用品种、种或屑与文件（品种说明书、标签等）是否相同，是否名副其实。按照国家规定，种子净度、水分、发芽率、真实性和纯度4项指标都必须达到标准，否则就是不合格种子[13]。

由于依靠种子外观鉴定种子真实性要求检验员具有丰富的经验，但易受主观因素的影响。特别是现在绝大部分种子实行包衣后，利用籽粒形态鉴定法的可信度大大降低。因此，可以利用SDS-PAGE凝胶电泳图谱来鉴别真假种子，依据某些特征值位置谱带的有无进行鉴定。如图4所示为宁麦919的真种子与假种子对比，可见2号种子在上部分有多条Rf特征值的谱带缺失，如0.07与0.10处的谱带缺失，可判定为假种子。

3 讨论

3.1 小麦种子蛋白多态性

本次试验发现，所选取的4个品种的小麦种子蛋白凝胶电泳图谱表现出了较好的多态性，品种与品种之间表现出了较好的多态性，便于分析区别。

3.2 可行性分析

该试验通过对SDS-PAGE电泳图谱的分析，发现不同小麦种子的SDS-PAGE的电泳谱带均表现出较强的多态性。电泳图谱的谱带较为清晰，层次分明且多态性较强，能有效鉴定不同品种小麦种子间的差异。但是，由于试验过程中存在一些人为因素的影响，如染色不均匀、脱色不充分，或因点样量的不同，从而影响品种鉴别的准确性。

图4 宁麦919真假种子对比

注：1为真种子，2为假种子。

但总体来说，本次试验可证明，利用SDS-PAGE凝胶电泳进行小麦种子真实性及纯度鉴定分析是可行的。

参考文献

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