前处理方法及冻融次数对尿液蛋白标志物质量影响的探究

李启沅，何旭珩，王 县，刘小盼，孙建波，廖秋燕，尹洁芳，贾 佳，唐中湘，李 雪

·生物标志物·

前处理方法及冻融次数对尿液蛋白标志物质量影响的探究

李启沅，何旭珩，王 县，刘小盼，孙建波，廖秋燕，尹洁芳，贾 佳，唐中湘，李 雪

目的探究不同前处理方法及冻融次数对尿液样本蛋白质量的影响。方法 取样后的尿液样本经过离心与不离心处理后，分别于室温及4℃冷藏放置4、12、24、48、72 h，及在－80℃反复冻融1、3、5、10次后，经过桥式酶联免疫吸附测定方法检测丛生蛋白、肾损伤分子-1、胱抑素C及视黄醇结合蛋白4种蛋白的质量浓度变化。结果 经离心处理的样本，在室温或4℃冷藏放置48 h后，丛生蛋白质量浓度显著降低。未经离心处理的样本，室温放置24 h后，丛生蛋白质量浓度显著降低；4℃冷藏条件下蛋白相对稳定，在放置72 h后显著降低。4种蛋白－80℃反复冻融1、3、5、10次后，质量浓度均无显著变化；未经离心处理样本，蛋白质量浓度较离心处理样本高。结论 在冷冻保存前，尽量将尿液样本先放置在4℃环境下处理或暂存，且暂存时间不超过72 h；若室温放置，时间不超过24 h；且根据研究用途决定是否离心。样本反复冻融10次对尿液蛋白质量无明显影响，可以根据检测需求及实际条件，确定样本是否分装及分装管数等。

尿液蛋白标志物；尿液储存；标志物质量

尿液是有重要意义的排泄物，其主要成分为尿素、无机盐、微量蛋白质、代谢物等，其成分的变化反映代谢异常、泌尿系统或其他组织器官的病变，可作为无创、有效的疾病诊断生物材料。其中，尿液中某些蛋白的变化是包括肾损伤等疾病的重要标志，为疾病的诊断提供参考[1-5]。尿液也是生物样本库存储重要的样本之一，其采集、处理与保存的规范化操作是质量控制的重要保证；要获得可靠的科学研究及应用成果，必须保证尿液样本完整性[6-7]。

丛生蛋白，相对分子质量为80×103，它与清除细胞的碎片和凋亡的细胞相关。研究表明，丛生蛋白可作为膀胱癌诊断标志物[8]。肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)是一种跨膜蛋白，可作为早期肾损伤的诊断标志物[9-10]。胱抑素C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，由122个氨基酸残基组成，相对分子质量为13.3×103，是一种低相对分子质量、碱性非糖化蛋白质，也是新近发展起来的评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标[11-12]。视黄醇结合蛋白(retinol binding protein，RBP)是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。测定RBP能早期发现肾小管功能损害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度，还可作为肾功能早期损害和监护治疗的指标[13-14]。

作者选用这4种常用作疾病诊断，且在健康人尿液中普遍存在的蛋白质作为研究对象，采用桥式酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)方法，探讨离心或者不离心情况下，前处理温度、前处理放置时间及反复冻融对尿液样本蛋白质量的影响，为优化样本采集、规范尿液样本前处理操作流程、保存条件及提高样本保存质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 收集来自健康成年人的晨尿样本，男女各2人，项目经国家基因库伦理委员会审批通过，捐赠者知情并签订知情同意书。96孔聚苯乙烯检查板与KIM-1、胱抑素 C、丛生蛋白及 RBP、ELISA试剂盒均购自美国R＆D公司，其中试剂盒中配备有各种蛋白相应的标准品和牛血清白蛋白。磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)为美国Gibco公司产品。FLUOstar Omega全自动多功能酶标仪，购自德国BMG公司。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 捐赠者采集晨尿样本50 mL于无菌的尿液采样杯中。

1.2.2 样本处理 尿液采集收集完毕后，即刻对样本进行分装处理。样本处理流程参照图1。所采集每份尿液50 mL充分混匀后，平均分成2部分，一部分经二步离心(1 600 r/min离心10 min后12 000 r/min再高速离心10 min)，以去除细胞及微粒等残渣；另一部分不经离心，直接进行分装。每部分样本平均分装成15管，每管1 mL，以进行尿液室温前处理时间稳定性、4℃前处理时间稳定性及－80℃反复冻融次数研究测试。其中10管样本分别在室温及 4 ℃条件下放置 4、12、24、48、72 h；4 管放置于－80℃冰箱进行反复冻融测试，冻融次数分别为1、3、5、10次；另分别有 1管样本，存放于－80℃作为项目对照样本，即对照组(0 h)，在室温处理检测和冻融检测中，分别与离心组、非离心组以及冻融检测组样本进行比较。1管PBS作为阴性对照。处理完的样本检测前暂存放于－80℃冰箱保存。

图1 尿液样本处理流程

1.2.3 ELISA 用PBS分别将KIM-1、胱抑素C、丛生蛋白及RBP捕获抗体蛋白稀释为一定比例，并包被在96孔板中，室温下孵化过夜。400 μL清洗液清洗每孔3次，加1%牛血清白蛋白稀释液300 μL，室温下孵化1 h。加入100 μL处理后的尿液样本、试剂盒配备的标准品或阴性对照品到相应孔位，室温孵化2 h，洗板3次。KIM-1、胱抑素C、丛生蛋白及RBP相应板中分别添加100 μL检测抗体，室温孵化2 h，洗板3次；加入100 μL链霉亲和素辣根过氧化物酶到每个孔；覆盖后在室温下避光孵化20 min，洗板3次。添加100 μL底物显色液，室温下避光孵化20 min；然后加入50 μL终止液，终止反应。在450 nm波长处检测各孔的光密度值，根据不同质量浓度的标准品光密度值绘制标准曲线，并计算出测试尿液样本的蛋白质量浓度。

1.3 统计学处理 采用GraphPad软件，室温前处理时间稳定性、4℃前处理时间稳定性及－80℃反复冻融测试样本与对照组间差异采用t检验；如果数据为非正态分布，以中位数[四分位数间距(25%，75%)]表示，2组间比较采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同前处理方式对样本质量影响 与对照组比较随着时间的延长，经离心处理后的尿液样本在室温和4℃存放条件下，丛生蛋白质量浓度呈降低趋势，且在48 h显著降低(t室温＝3.005、P室温＝0.023 9，t4℃＝3.232，P4℃＝0.017 9)；而其他 3 种蛋白质量浓度无明显变化。见图2。未经离心处理的尿液样本，室温放置24 h后丛生蛋白质量浓度即出现显著降低(t＝2.574，P＝0.049 8)，4 ℃放置 72 h后也显著降低(图3)；其他3种蛋白质量浓度无明显变化。未经离心的尿液样本丛生蛋白的起始质量浓度高于经离心处理的样本。

图2 经离心处理后的尿液丛生蛋白质量浓度

图3 未经离心处理的尿液丛生蛋白质量浓度

2.2 冻融次数对样本质量影响 相较离心处理样本，未经离心处理的 KIM-1(t＝2.063、P＝0.085)和丛生蛋白(t＝1.920、P＝0.103)的初始质量浓度偏高，但差异无统计学意义(表1)。

尿液样本在反复冻融1、3、5、10次后，4种蛋白质量浓度均无显著变化(图4)。

表1 不同冻融次数尿液4种蛋白质量浓度变化(pg/mL)

图4 不同冻融次数尿液蛋白质量浓度

3 讨论

本研究中选用丛生蛋白、KIM-1、胱抑素C、RBP 4种蛋白进行特异性检测，研究不同处理方式对尿液样本中蛋白质量的影响。结果显示，随着放置时间的延长，在室温或4℃条件下放置的尿液样本中，丛生蛋白质量浓度有下降趋势；经离心处理的样本，在室温或4℃放置48 h后，丛生蛋白质量浓度显著降低。未经离心处理的样本，室温放置24 h后，蛋白质量浓度便出现显著降低；4℃条件下蛋白相对稳定，在放置72 h后显著降低。对于离心/不离心处理的样本，4℃相较于室温，尿液蛋白更稳定，质量变化更小，更利于样本质量的保存。与丛生蛋白相比，其他3种蛋白相对稳定，经过处理质量浓度无明显变化。4种蛋白－80℃反复冻融1、3、5、10次后，质量浓度均无显著变化，未经离心处理样本蛋白质量浓度较离心处理样本高。

总的来说，放置温度、时间及是否经离心处理在一定程度上影响着尿液蛋白质量的变化。然而，目前缺乏比较通用有效的生物标志物实时检测方法，尿液样本无法立即进行分析处理；且对于检测中心而言，并不是所有的检测中心都建立了完善的检测方法。因此，尿液样本的暂存和运输在实际情况中通常无法避免。本研究对尿液样本检测前的前处理条件进行了探索。

根据研究结果显示，KIM-1、RBP、胱抑素C 3种蛋白标志物无论是否经过离心处理，在72 h以内处理对临床结果无明显影响。如果客观检测条件不能满足，可暂且将尿液存放在4℃冷藏，72 h以内分析生物标志物即可。如果涉及尿液样本的运输，最好保证在室温条件下不超过72 h。而丛生蛋白，稳定性相对较差，最好在室温24 h以内就处理，如果存放在4℃则可适度延长至48 h以内处理。经过反复冻融10次，尿液中蛋白标志物均未受明显影响，因此尿液样本可先在－80℃储存，在长期稳定性有效期内检测即可。结合Adamo等[15]研究的长期稳定性结果，丛生蛋白在－80℃条件下可储存3个月，而KIM-1和胱抑素C在－80℃条件下可储存达12个月。因此，可根据检测需求及实际条件，确定样本是否分装及分装管数等，在长期稳定性有效期内对不同标志性蛋白进行检测。

4种蛋白中，丛生蛋白在不同放置温度、时间下，尿液蛋白质量浓度变化明显，这一结果也与Adamo等[15]之前针对丛生蛋白的长期稳定性研究结果一致。这可能是由丛生蛋白的结构特点造成的。丛生蛋白较RBP和胱抑素C小分子蛋白相对分子质量偏大，且是由二硫键连接的异源二聚体蛋白，容易发生聚合形成二聚体、四聚体以及更高相对分子质量的寡聚物，从而对以ELISA法为基础的质量浓度检测造成影响[16]。丛生蛋白对存储条件的变化敏感性高，因此该蛋白可作为尿液质控的标志性蛋白。

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Effects of pretreatment and freeze-thaw cycles on urinary biomarkers

LI Qiyuan， HE Xuheng， WANG Xian， LIU Xiaopan， SUN Jianbo， LIAO Qiuyan，YIN Jiefang， JIA Jia， TANG Zhongxiang， LI Xue
(China National GeneBank， BGI-Shenzhen， Shenzhen Guangdong 518083， China)

ObjectiveAimed to explore the effects of different pretreatment methods and freeze-thaw cycles on the quality of various urinary biomarkers.Methods Centrifuged or uncentrifuged urine samples were processed and stored at room temperature of 4℃ for 4，12，24，48 and 72 hours with freeze-thaw for 1， 3， 5， 10 cycles respectively.Then four urinary biomarkers including clusterin，kidney injury molecule 1(KIM-1)， cystatin C and retinol binding protein(RBP)were detected by enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA).Results After stored at room temperature for 48 hours，the clusterin biomarker from centrifuged urine samples showed a significant reduction in concentration.While for the uncentrifuged urine samples，the cluster in biomarker showed a significant reduction in concentration after stored at room temperature for 24 hours or 4℃for 72 hours.After multiple freeze-thaw cycles， all 4 urinary biomarkers were stable， and the initial concentrations were higher for those urinary biomarkers from uncentrifugated urine samples.Conclusion Before detection or cryopreservation，urine samples were recommended to store at 4℃for maximum period of 72 hours，and stored at room temperature for no more than 24 hours.No significant degradation was detected for the four urinary biomarkers after freeze-thaw for 10 cycles，and the urine samples could be aliquoted and freezed based on research requirements.

Urinary biomarkers； Urine storage； Biomarker quality

Q592.2

A

2095-3097(2017)05-0257-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.05.001

深圳市科技计划项目(JCYJ20160510141910129)

518083广东 深圳，深圳华大基因研究院国家基因库(李启沅，何旭珩，王 县，刘小盼，孙建波，廖秋燕，尹洁芳，贾 佳，唐中湘，李 雪)

[注 明]李启沅，何旭珩:并列第一作者

2017-03-13 本文编辑:徐海琴)