缺血低氧性脑损伤对未成熟新生大鼠神经元和髓鞘的影响

杨丽君+崔红

[摘要] 目的 探讨大鼠缺血低氧脑损伤对于神经元和髓鞘的影响情况。 方法 将3日龄SD新生大鼠随机分为对照组和缺血低氧处理组，对照组不予任何特殊处理，缺血低氧处理组大鼠行左颈总动脉结扎术后休息1～2 h入封闭容器，充以8%O2+92%N2的混合气体，处理时间为120 min，之后恢复正常氧供。待造模完成后3 d时进行尼氏小体染色探讨两组大鼠神经元的情况，造模后7 d进行劳克坚牢蓝染色探讨两组大鼠的髓鞘情况。 结果 尼氏染色结果提示，与对照组相比，缺血低氧处理之后大鼠脑组织中的神经元尼氏小体染色密度明显降低；劳克坚牢蓝染色结果显示，与对照组相比，缺血低氧处理组的髓鞘明显受损。 结论 大鼠缺血低氧性脑损伤对脑组织的神经元和髓鞘造成了一定程度的影响，进而导致脑组织相关的功能损伤。

[关键词] 脑损伤；缺血；低氧；神经元；髓鞘

[中图分类号] R741 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）25-0030-03

Effects of hypoxic-ischemic brain damage on neurons and myelin in immature neonatal rats

YANG Lijun CUI Hong

Department of Pediatrics， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of ischemia and hypoxic brain injury on neurons and myelin in rats. Methods Three-day-old SD neonatal rats were randomly divided into two groups including control group and ischemia-hypoxia treatment group. The control group wasnt given any special treatment. Rats in the ischemia and hypoxia treatment group were put into the closed container after left common carotid artery ligation operation and resting 1-2 hours， and the container was filled with 8%O2+92%N2 mixed gas， with the treatment time of 120 minutes， afterwards returning to normal oxygen supply. The neurons in the two groups were examined by Nedinite staining at 3 days after the completion of the modeling. The myelin sheathes of the two groups were explored by Luxol Fast Blue staining at 7 days after the compeletion of the modeling. Results The results of Nissl staining showed that， compared with that of the control group， the density of neonatal body staining was significantly decreased in the brain tissue of rats after ischemia and hypoxia treatment. Luxol Fast Blue staining results showed that the myelin sheath of the ischemic hypoxia treatment group was significantly impaired， compared with that of the control group. Conclusion Hypoxic-ischemic brain damage in rats has a certain effect on the neurons and myelin sheath of brain tissue， leading to brain tissue-related functional damage.

[Key words] Brain injury； Ischemia； Hypoxia； Neurons； Myelin sheath

缺氧缺血性腦损伤（hypoxia ischemia brain damage，HIBD）是围产期引起早产儿和正常足月儿大脑损伤和长期神经系统后遗症的最重要因素[1]，研究发现HIBD是导致新生儿死亡的重要原因，也是引起脑瘫等严重后遗症的重要原因[2]。有证据表明，在发达国家HIBD的发生率为1‰～8‰，不发达国家发病率甚至高达26‰[3，4]。造成HIBD的原因很多，如出生时产程延长、胎儿脐带绕颈等均有罹患HIBD的更高风险[5]，此外，早产是造成新生儿HIBD的另外一个重要的危险因素[6，7]。由于早产儿结构的不成熟，对于缺氧缺血的损伤反应更为剧烈，主要表现为脑室周围白质软化（periventricular leukomalacia，PVL）[8-10]。早期研究发现早产儿HIBD最主要的病理改变是脑白质损伤[11]，但近年来的研究者认为，早产儿HIBD从本质上来说是一种全脑的损伤[12]，亦即缺氧缺血除了影响神经胶质细胞之外，对神经元也造成相当严重的影响。endprint

本研究采用3日龄SD大鼠为在体实验的研究对象，用实验动物模拟建立人类的早产儿HIBD模型，在不同时间点探讨缺血低氧对脑组织神经元和髓鞘的影响，进一步探讨脑神经受缺血低氧影响的机制，为日后进行早产儿缺氧缺血脑损伤的合理、有效的治疗提供一定的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级别3日龄的SD大鼠（体重8～10 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2012-0001]。自制封闭容器，8%O2+92%N2的混合气体由首都医科大学附属北京友谊医院统一提供。

1.2 缺血低氧模型的建立

将SPF级3日龄的SD大鼠（共20只）随机分为对照组和缺血低氧处理组，对照组不予任何处理，缺血低氧处理组首先进行缺血模型的建立，4%水合氯醛按照10 μL/10 g的量对大鼠乳鼠进行麻醉，固定在手术木板上之后，取左锁骨上位置进行开口，开口0.8～1 cm左右，小心探查，寻找左颈总动脉，用玻璃分针小心分离动脉，穿入2根6-0的手术线，分别结扎，两个结扎点之间离断动脉，然后缝合，回母鼠身边休息1～2 h，之后入自制封闭容器，充以8%O2+92%N2的混合气体（37℃水浴），时间为120 min，之后回母鼠身边休息。

1.3 尼氏小体染色步骤

焦油紫（甲酚紫，cresyl violet，CV）染色液的配制方法：溶液A：取冰醋酸4.6 mL，加水至400 mL，溶液B：取2.72 g无水乙酸钠，加水至100 mL，将328 mL 溶液 A与72 mL 溶液 B混合后调pH至4.0（用冰乙酸），上述溶液中加入0.4 g焦油紫，充分进行混匀，静置一周后待用。具体染色步骤如下：冰冻切片从冰箱中取出后充分晾干，入70%酒精中4 h进行脱脂，之后入蒸馏水洗数分钟，0.1%焦油紫醋酸水溶液染色5 min，最后入100%酒精1 min，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.4 劳克坚牢蓝（luxol fast blue，LFB）染色步骤

取对照组和HI组冰冻切片脱水至100%酒精，入LFB染液中37℃过夜（16～24 h），冷却至室温，在95%酒精浸泡3～5 min洗去多余染液，用蒸馏水洗3 min，之后入0.05%碳酸锂分色10 s，再次用蒸馏水洗3 min，入70%酒精分色，最后用梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

2 结果

2.1 缺血低氧模型成功建立

课题组前期进行了大量的缺血低氧性脑损伤相關的工作，能够熟练建立相关的动物模型，动物模型的存活率几乎可以达到100%。造模后常规行HE染色，确认模型建立成功与否。

2.2 尼氏小体染色

使用自配的焦油紫染色液按照染色步骤进行脑组织神经元尼氏小体的染色，结果提示，缺血低氧3 d后，神经元尼氏小体数量明显减少，且与对照组相比，尼氏小体分布不均匀，颜色变浅，深浅不一，透明度也变得不一致。见封三图4。

2.3 劳克坚牢蓝染色

LFB染色结果提示，缺血低氧发生7 d后，胼胝体区以及侧脑室周边区域的髓鞘蓝染降低，与对照组染色的鲜艳蓝色不同，缺血低氧处理组的染色偏红，提示缺血低氧7 d后，脱髓鞘现象非常严重。见封三图5。

3 讨论

缺氧缺血脑损伤是临床常见胎儿/新生儿脑损伤，主要原因在于局部或完全脑缺氧、血流量减少或暂停，有较高的死亡率和致残率，引起HIBD原因很多，其中早产是造成HIBD的重要因素之一，早产儿HIBD表现较足月儿更为严重，随着围产医学的快速发展，早产儿存活率也随之上升，近年来早产儿的结局也有了很大的改善，但早产儿由于脑损伤而带来的后遗症仍是不可忽略的社会问题。HIBD的发病机制非常复杂，目前仍尚未完全阐明，有研究者认为HIBD损伤的主要细胞为少突胶质细胞[13-16]，认为少突胶质细胞祖细胞是HIBD的易损细胞，但后来一些研究发现[17-19]HIBD是一种全脑损伤，HIBD发生时除了累及神经胶质细胞，神经元也受到严重损伤，本研究对此进行了探讨，结果发现在缺血低氧的刺激下，尼氏小体数量明显降低。研究认为[20]尼氏小体是由许多规则而成平行排列的粗面内质网和其间的游离蛋白体以及多核蛋白体组成的聚合体，为神经元合成蛋白质的主要场所，分布于神经元胞浆的嗜碱性颗粒。尼氏小体的功能与神经元的功能存在密切的关系，轴突蛋白质大多来自神经元胞体的尼氏小体，神经元在其兴奋传导过程中，需要不断消耗某些蛋白质物质，尼氏小体可提供新的蛋白质以补充这种消耗[21]。正常情况下，尼氏小体在神经元中的数量和分布具有特定性，但病理情况下，神经元变性时，尼氏小体的变化非常敏感，逐渐由正常的块状或颗粒状变成粉末状甚至消失，本研究发现缺血低氧3 d后，与对照组相比，神经元尼氏小体数量明显减低，尼氏小体分布不均匀，颜色变浅，深浅不一，透明度也变得不一致。

造模7 d时间点的劳克坚牢蓝染色结果显示，缺血低氧刺激下，即损伤发生后7 d脑组织胼胝体区域（corpus callosum，cc）和侧脑室（lateral ventricle，LV）周边髓鞘蓝染率仍下降明显，提示缺血低氧导致的髓鞘损伤和脱髓鞘情况较严重。既往研究发现，HIBD发生时，少突胶质细胞的祖细胞对于缺氧缺血的刺激较为敏感，在此过程中易于受到严重影响，继而导致髓鞘受损严重[22-24]，本研究也证明了这一点。

综上，研究发现在缺血低氧脑损伤发生时，尼氏小体受到严重的影响，髓鞘也由于缺血低氧的刺激导致大量脱失，因此，如何增加缺血低氧后脑组织神经元尼氏小体的存活、维持髓鞘的数量以及进行髓鞘再生的治疗也许是未来对早产儿HIBD治疗的另一个可能的潜在方向。

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