白细胞介素-6受体基因非同义变异rs2228145和中国过敏性鼻炎病人的相关性研究

赵亚丽 张 媛 王成硕 张 罗*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院过敏科，北京 100730; 2.北京市耳鼻咽喉科研究所 鼻病研究北京市重点实验室，北京 100005; 3.首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，北京 100730)

·鼻部慢性炎症·

白细胞介素-6受体基因非同义变异rs2228145和中国过敏性鼻炎病人的相关性研究

赵亚丽1,2,3张 媛1,2,3王成硕3张 罗1,2,3*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院过敏科，北京 100730; 2.北京市耳鼻咽喉科研究所 鼻病研究北京市重点实验室，北京 100005; 3.首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，北京 100730)

目的过敏性鼻炎是鼻部黏膜的慢性炎性疾病，其发病受遗传和环境因素双重影响，过敏性鼻炎和哮喘在临床表现和遗传基础具有交叉重叠。本研究拟对在全基因组关联分析中发现的和哮喘相关的白细胞介素-6受体(interleukin-6 receptor，IL-6R)基因的rs2228145位点进行分析，检测其和中国过敏性鼻炎病人的相关性。方法收集402例明确诊断为过敏性鼻炎病人，以及416例正常对照，所有个体均为中国汉族。从外周血白细胞提取基因组DNA，应用时间飞行质谱的方法进行基因分型。结果等位基因分析显示过敏性鼻炎及正常对照在IL-6R基因的rs2228145位点等位基因频率存在差异(P=0.0039，Pcorrected=0.001 6)。基因型分析进一步验证了该位点和过敏性鼻炎的相关性，共显性模型(PA/C vs A/A=0.000，ORA/C vs A/A=0.546,95%CI：0.389～0.766)和显性模型(PA/C+C/C vs A/A=0.001，ORA/C+C/C vs A/A=0.575,95%CI：0.418～0.790)分析在病例组和对照组差异有统计学意义。结论结果提示和哮喘相关基因IL-6R的rs2228145位点和过敏性鼻炎的发病有关，可降低其发病的风险。

过敏性鼻炎；哮喘；白细胞介素6受体； 关联分析

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是鼻部黏膜的慢性炎性疾病，发病率在全球有增高的趋势，可达10%～25%[1]，临床特征为鼻痒、流涕、反复喷嚏及鼻堵[2-3]。有学者[4]认为，过敏性鼻炎的发病受遗传因素和环境因素的双重影响，遗传因素在过敏性鼻炎的发病中具有重要作用，遗传度可达70%～90%。在过去的十年，连锁分析和候选基因分析方式确定了少数和过敏性鼻炎相关的基因及位点，然而，这些位点在人群中的可重复性较差。全基因组关联分析是随着基因芯片技术的发展而逐渐应用的，对于复杂疾病易感基因的研究可以弥补候选基因局限于特定区域的不足，可以将易感基因定位于较小范围内，弥补连锁分析的局限性，可以无偏倚的在全基因组范围内发现可能和疾病相关的易感基因，具有高效、全面的特点。目前，过敏性鼻炎的全基因组关联分析较少，发现的比较确定和疾病相关的基因仅有6个：MRPL4、BCAP、C11orf30、LRRC32、FERD3L和ORMDL3[5-7]。

“同一气道，同一疾病”，过敏性鼻炎和哮喘在表型和发病机制方面均具有相关性。据报道[3]，很大一部分过敏性鼻炎病人会有哮喘的临床表现，并且，过敏性鼻炎可以使得哮喘发病的概率增加[8-9]。过敏性鼻炎和哮喘在遗传学发病机制上具有部分交叉重叠，部分基因和过敏性鼻炎和哮喘均相关。17q21区域是和哮喘密切相关的区域，为了验证其和过敏性鼻炎的相关性，Tomita等[7]在两个独立的日本过敏性鼻炎人群进行了分析，发现该区域ORMDL3基因和过敏性鼻炎相关。

然而，无论候选基因关联研究和基于芯片的全基因组关联研究，发现的位点多数不是和疾病直接相关的位点，而是和功能变异处于连锁不平衡区域的标记，并且目前发现的过敏性鼻炎的易感的变异仅能解释部分过敏性鼻炎的发病机制。处于基因编码区的变异可以改变基因编码，从而影响其功能，其可能是和疾病直接相关的变异。

白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一个复杂的细胞因子，直接参与多种炎性反应。遗传学研究[10]显示，其受体基因IL-6R和多种慢性炎性反应性疾病相关。全基因组关联研究及后续的候选基因分析显示其非同义变异rs2228145变异可增加哮喘的易感性[11]，而对于冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)[12]、风湿性关节炎[13]以及腹主动脉瘤[14]具有保护性作用。本课题组在前期对于过敏性鼻炎小家系的全基因组测序分析中发现IL-6R基因的rs2228145变异可能和疾病相关(数据尚未发表)。本研究拟在过敏性鼻炎病人中分析哮喘易感基因IL-6R的rs2228145位点疾病的相关性。

1 资料与方法

1.1样本收集

本研究获首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会批准，符合世界卫生组织的《赫尔辛基宣言》。所有采集病例及标本的病人及正常对照均签署了知情同意书，对于未成年人由其监护人代签。

过敏性鼻炎病人均由有经验的耳鼻咽喉科医师诊断。 入选标准，选取中国北京地区长期居住的AR确诊病例，所有受试者均出现鼻塞、清水样涕、鼻痒和喷嚏等症状2项或2项以上；查体可见鼻黏膜苍白、水肿和清水样分泌物；常见吸入性过敏原的皮肤点刺试验(skin prick test，SPT)(采用默克公司生产的诊断试剂)和血清特异性IgE(specific IgE，sIgE)(采用Phdia公司的诊断试剂)检测均显示至少有一种过敏原阳性(SPT≥++；sIgE≥2级)。吸入性致敏原包括动物毛(仓鼠上皮、狗上皮、兔上皮、猫上皮、豚鼠上皮)、树1(榛属、杨属、榆科、柳属、桤木)、树2(桦木、水青冈、栎属、悬铃木属)、禾本科(天鹅草、鸭茅、黑麦草、梯牧草、龙须草、牛尾草)、禾本科/谷类(禾木科、大麦、燕麦、黑麦、小麦)、艾蒿、蒲公英、大豚草、藜、葎草、刺槐、德国小蠊、松、长叶车前草、新月弯孢属、白色念珠菌、特异青霉、交链孢霉属、烟曲霉菌、粉尘螨和屋尘螨。排除标准：排除鼻腔良、恶性肿瘤。

收集416例地域匹配的中国汉族正常对照，无过敏性疾病病史或无鼻及鼻腔疾病者作为正常对照，包括210名女性，206名男性。对照的年龄分布为3岁至80岁，平均年龄(35.8±15.0)岁。

1.2单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorphism,SNP)选择

选择在哮喘的全基因组关联分析中显示和疾病相关的IL-6R基因的非同义变异rs2228145位点作为本研究的候选位点，分析其和中国过敏性鼻炎病人的相关性。

1.3基因分型

本研究收集的所有病例及对照均采集外周血，从外周血白细胞提取基因组DNA。基因组DNA提取试剂盒提取DNA(天根生化科技公司，北京)。提取的基因组储存在4 ℃冰箱备用。应用时间飞行质谱的方法对选取的rs2228145位点进行基因分型，引物及探针应用MassARRAY Assay Design 4.0软件设计。应用384孔板进行聚合酶链反应，采用MassARRAY Typer4.0软件进行数据分析。每个384孔板应用5个空白及5个重复样本进行质控。

1.4统计学方法

应用Genetic Power Caculator软件计算本研究的统计学效力[15]。应用4.1版Haploview 软件(Broad研究所)进行位点筛选，应用χ2检验的方法分析位点基因分型结果在正常人群中是否符合Hardy-Weinberg平衡，对于P值小于0.05的位点将不进行进一步的关联分析。

应用11.0版STATA统计学软件(Stata公司)进行病例组和对照组间的关联分析。过敏性鼻炎病人组和正常对照组等位基因及基因型频率差异分析采用χ2检验。应用10 000 置换的方法对P值进行校正。应用Akaike’s 信息标准(Akaike’s information criteria, AIC)选择最佳基因型模型。应用非条件的回归分析计算OR值和95%的可信区间。

2 结果

过敏性鼻炎组及正常对照组样本的基本信息详见表1，在本研究纳入的过敏性鼻炎病人组中，22例病人具有慢性鼻窦炎病史，281例未合并慢性鼻窦炎；21例合并哮喘病史，282例未合并哮喘，其他99例病例未获得详细的病史。在进行DNA提取基因分型中，19例过敏性鼻炎病人和19例正常对照实验失败，因此，最终对383例病人及397例正常对照进行了数据的统计分析。详见表2。

等位基因分析结果如表3。该分析显示IL-6R基因的rs2228145位点的等位基因频率在病例组和对照组差异有统计学意义(P=0.0039)，P值经10 000次permutation校正后仍具有统计学意义(Pcorrected=0.001 6)，提示该位点可能和疾病相关。

表1 收集AR及正常对照个体的基本信息Tab.1 Demographic characteristics of AR andcontrol subjects [，n(%)]

AR：allergic rhinitis;CRS：chronic rhinosinusitis;*Details about complications with CRS or asthma were not recorded for 99 cases.

基因型分析结果详见表4。基因型分析采用AIC准则选择最佳的基因型模型，分别对rs2228145位点基因型按照共显性模型、显性模型和隐性模型进行了分析。结果显示该位点在共显性模型(A/CvsA/A)病例组和对照组基因型频率存在差异，PA/C vs A/A=0.000，ORA/C vs A/A=0.546,95%CI：0.389～0.766；同时，显性模型(A/C+C/CvsA/A)分析病例组和对照组基因型频率存在差异，PA/C+C/C vs A/A=0.001，ORA/C+C/C vs A/A=0.575,95%CI：0.418～0.790；共显性模型(PC/C vs A/A=0.072，ORC/C vs A/A=0.662,95%CI：0.423～1.038)尽管没有达到明显差异，仍提示基因型频率在该模型具有不同的趋势。隐性模型(C/CvsA/A +A/C)分析时未显示出明显差异，PC/C vs A/A+A/C=0.718，ORC/C vs A/A+A/C=0.928,95%CI：0.618～1.394。结果提示IL-6R基因的rs2228145(Asp358Ala)位点变异和过敏性鼻炎相关，变异等位基因C编码氨基酸358Ala对于过敏性鼻炎的发病具有重要的保护性作用(OR<1)。

表2 基因分型及Hardy-Weinberg平衡检验结果Tab.2 SNPs genotyped and their Hardy-Weinberg (HWE) thresholds

SNP:single-nucleotide polymorphism;IL-6R: interleukin-6 receptor;AR:allergic rhinitis.

表3 rs2228145位点在AR病例组和对照组等位基因频率差异分析结果Tab.3 Allele frequencies of rs2228145 investigated among AR and control subjects

表4 rs2228145位点在AR病例组和对照组基因型频率差异分析结果Tab.4 Genotype of rs2228145 investigated among AR and control subjects

SNP:single-nucleotide polymorphism;AR:allergic rhinitis.

3 讨论

过敏性鼻炎和哮喘在临床表现及遗传基础上存在部分交叉重叠，过敏性鼻炎可增加哮喘的发病概率[3,8-9]。因此，本研究选取了在哮喘的全基因组关联研究[11]中发现的，并在多个研究中[16-17]得到了验证的和哮喘相关的基因IL-6R的非同义变异rs2228145(Asp358Ala)位点进行分析，探讨其和中国过敏性鼻炎的相关性。本研究中笔者发现IL-6R基因的变异位点rs2228145(Asp358Ala)和过敏性鼻炎相关，有意思的是，与哮喘相关研究不同，笔者发现较低频率等位基因C在过敏性鼻炎的发病中可能发挥重要的保护性作用，而不是增加过敏性鼻炎的患病风险。

IL-6R基因编码蛋白的配体：IL-6是一种复杂的细胞因子，目前被认为是人类最为多效的细胞因子，可以激活系列细胞，在调节炎性反应中发挥着重要的作用。IL-6R基因变异和多种疾病的发病相关：IL-6R和哮喘相关性是在一项对欧裔人群的大规模的全基因组关联分析[11]中发现的，在其研究中发现位于内含子区域的rs4129267变异和哮喘发病相关，可增加哮喘的易感性(OR=1.09,Pcombined=2.4×10-8)。变异rs4129267和非同义变异rs2228145位点位于同一个连锁不平衡的区域，因此，Hawkins等[16]在候选研究中选择具有氨基酸编码改变的rs2228145位点在欧裔人群进行了进一步研究，发现rs2228145位点变异等位基因和哮喘肺功能表型相关，这一结果在对于中国哮喘病人的研究[17]中得到结果相似。对于风湿性关节炎的研究[13]显示IL-6R基因的非同义变异rs8192284和疾病相关(OR=0.9,P=1.3×10-8)，该位点与和哮喘相关的rs4129267处于连锁不平衡区域(r2=0.97,D′=1)，该变异的较低频率等位基因对于风湿性关节炎具有保护性作用。对于腹主动脉瘤的研究[16]显示IL-6R基因的rs752922位点(可作为rs2228145的tag SNP，r2=0.97)和疾病相关，可降低疾病发病的风险(OR=0.84，P=2.7×10-11)。此外，还发现IL-6R基因的rs2228145和冠心病有关，C等位基因358Ala具有降低该病风险的作用[12]。

IL-6是一种多效的细胞因子，IL-6可控制T细胞的激活，分化反应，促进炎性反应环境的形成，因此其可参与多种自身免疫性和炎性疾病的发生[10]。IL-6与膜结合的IL-6受体相结合可以诱导其与gp130的二聚体的形成，从而促进转录因子STAT3和STAT1的磷酸化[18]。循环性IL-6受体由变异的膜结合IL-6受体剪接形成，或者由异构体RNA编码形成[18]。循环性受体与IL-6结合可直接刺激gp130的表达增高[19]。rs2228145位点位于膜性IL-6R的剪接位置，基因变异后编码形成循环性IL-6受体，因此，当等位基因发生Asp358Ala变异时，膜结合IL-6R表达降低，sIL-6R增多，并与IL-6R结合，降低STAT3 和 STAT1转录因子的活化，从而抑制IL-6诱导的级联反应，从而导致系列疾病的发生。

IL-6R的rs2228145位点变异在保持膜性IL-6R和sIL-6R的平衡方面发挥重要作用。相同的变异和不同的炎性疾病相关，其作用机制尚很难阐明，可能和其他的变异或者基因的相互作用有关。Revez等[20]研究发现，在IL-6R基因及附近区域，除了rs2228145，rs12083537位点对于sIL-6R水平具有影响作用。其团队[21]还发现STOML2基因的表达可和IL-6R基因表达相关，两基因可能在哮喘发病中具有相互调节的作用。IL-6R基因的rs2228145位点变异和过敏性鼻炎的发生相关，可降低过敏性鼻炎的发病风险，其机制尚难阐明，可能也存在其他基因及变异的相互作用，有待于进一步深入研究。

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Non-synonymousvariantrs2228145ininterleukin-6receptor(IL-6R)geneisassociatedwithallergicrhinitisinChinesesubjects

Zhao Yali1,2,3, Zhang Yuan1,2,3, Wang Chengshuo3, Zhang Luo1,2,3*

(1.DepartmentofAllergy,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100730,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofNasalDiseases，BeijingInstituteofOtorhinolaryngology,Beijing100005,China; 3.DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100730,China)

ObjectiveAllergic rhinitis (AR) is a complex chronic inflammatory disease of the nasal mucosa, caused by an interaction between genetic and environmental factors. As evidence suggests that a proportion of individuals with AR also present symptoms of asthma and some genetic variants may have increased susceptibility to both AR and asthma. The objective of this study was to identify whether asthma susceptibility variant rs2228145 in interleukin-6 receptor (IL-6R) is associated with AR in the Chinese population.MethodsA cohort of 402 individuals with physician diagnosed AR and 416 healthy controls were recruited from the Han Chinese population in Beijing. DNA was extracted from the peripheral blood. rs2228145 was genotyped using the sequenom mass array technology platform.ResultsAnalysis of frequency differences of allele between the AR patients and control subjects showed that rs2228145 inIL-6Rwas significantly associated with AR (P=0.0039，Pcorrected=0.001 6). Genotype analysis further confirmed the difference in distribution of this variant between AR patients and controls in both the co-dominant (PA/C vs A/A=0.000，ORA/C vs A/A=0.546,95%CI：0.389-0.766)and dominant (PA/C+C/C vs A/A=0.001，ORA/C+C/C vs A/A=0.575,95%CI：0.418-0.790) models.ConclusionThese results suggest that the rs2228145 inIL-6Rgene is associated with decreased risk for AR.

allergic rhinitis; asthma; interleukin-6 receptor; association studies

国家自然科学基金(81400470,81570895),北京市卫生系统高层次卫生技术人才科研骨干项目(2014-3-015)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81400470,81570895), Beijing Health Bureau Program for High Level Talents (2014-3-015).

*Corresponding author， E-mail：dr.luozhang@139.com

时间：2017-10-14 16∶06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171014.1606.018.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.05.013]

R765

2017-07-07)

编辑 孙超渊