阿霉素联合热疗、程序死亡受体配体1抗体对胶质瘤细胞的影响

张海峰，郑士亚，欧阳彬，杨登元，刘文庆，田继辉*

(1.江苏省南京市中心医院外科，江苏 南京 210000；2.东南大学医学院肿瘤学系，江苏 南京 210000；3.宁夏医科大学附属总医院神经外科，宁夏 银川750004)

·论著·

阿霉素联合热疗、程序死亡受体配体1抗体对胶质瘤细胞的影响

张海峰1，郑士亚2，欧阳彬1，杨登元1，刘文庆3，田继辉3*

(1.江苏省南京市中心医院外科，江苏 南京 210000；2.东南大学医学院肿瘤学系，江苏 南京 210000；3.宁夏医科大学附属总医院神经外科，宁夏 银川750004)

目的探讨阿霉素联合热疗、程序死亡受体配体1抗体对胶质瘤细胞的增殖抑制作用，以及阿霉素联合热疗对U251胶质瘤细胞表面程序死亡受体配体1表达的影响。方法采用CCK-8法确定阿霉素的半抑制浓度。建立U251与T细胞共培养体系，采用CCK-8法检测不同处理组(阿霉素组，热疗组，程序死亡受体配体1抗体组，阿霉素联合热疗组，阿霉素联合程序死亡受体配体1抗体组，热疗联合程序死亡受体配体1抗体组，阿霉素联合热疗、程序死亡受体配体1抗体组)的细胞增殖抑制率。采用流式细胞术检测阿霉素联合热疗对U251胶质瘤细胞表面程序死亡受体配体1表达的影响。结果阿霉素联合热疗、程序死亡受体配体1抗体相比单一治疗方法抑制细胞增殖能力更强；阿霉素联合热疗可以上调胶质瘤细胞表面程序死亡受体配体1的表达。结论阿霉素联合热疗、程序死亡受体配体1抗体是一种很有前景的联合治疗胶质瘤方式，可为未来进一步探索胶质瘤治疗新策略提供实验依据。

神经胶质瘤；免疫疗法；温热疗法；阿霉素

神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，大约占所有颅内肿瘤的50%，占所有原发性脑肿瘤的15%。目前，以手术切除为主的综合治疗是神经胶质瘤的主要治疗方法，然而由于胶质瘤呈浸润性生长，恶性程度高，增殖、迁移侵袭性强，胶质瘤患者的生存期仍然很短，预后不容乐观[1]。因此，探索新的有效的治疗方法至关重要。近10年来，免疫治疗取得了突破性进展，这很大程度上归功于免疫控卡点尤其是免疫负性调控点的发现[2-5]。基于程序死亡受体1(programmeddeath-1,PD-1)和程序死亡受体配体1(programmeddeathligand-1,PD-L1)的免疫治疗成为免疫治疗中的主力军[6-7]。其对黑色素瘤、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等均显示出良好的效果[8-10]。但单用PD-1/PD-L1抑制剂还是不能使所有患者获益。为此，本研究探索一种联合治疗模式，即PD-L1抑制剂联合阿霉素联合热疗，并观察阿霉素联合热疗对胶质瘤细胞PD-L1表达的影响，旨在为寻求胶质瘤有效的联合治疗方法提供理论依据。

1 资 料 与 方 法

1.1 细胞与试剂 人胶质瘤细胞株U251为东南大学附属中大医院外科研究所提供；RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；盐酸阿霉素由深圳万乐药业有限公司生产；PD-L1抗体购自Bioxcell公司；PE-PD-L1抗体购自Biolegend公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞传代培养 人胶质瘤细胞U251培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每3～5d更换培养液传代。实验采用对数生长期细胞。

1.3 药物半抑制浓度(half-inhibitoryconcentration，IC50)的确定 离心收集U251细胞，用RPMI1640培养液稀释成2×104个/mL的细胞悬液，接种至96孔板；阿霉素稀释成8个浓度组(0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00mg/L)加入96孔板中。孵育48h后加入10μLCCK-8试剂，4h后取出96孔板，在450nm波长处测定各孔OD值，参比波长为650nm。计算各浓度组细胞活性率=实验组OD值/对照组OD值×100%，绘制浓度-细胞活性率曲线并拟合方程，计算IC50。

1.4CCK-8法测定细胞增殖抑制率

1.4.1 外周血T淋巴细胞的制备 征得胶质瘤患者同意后，取其外周血。采用Ficoll密度梯度离心，1 800r/min，30min，小心吸取白膜层即获得人外周单个核细胞，加入细胞因子CD28、IL-2，置于细胞培养箱孵育。

1.4.2U251与T细胞共培养体系建立 取制备好的人T细胞(1×105/孔)和U251细胞(2×104/孔)接种于96孔板，建立200μL/孔体系。

1.4.3 细胞分组 将U251与T细胞共培养体系分为8组：对照组、阿霉素组、热疗组、PD-L1抗体组、阿霉素联合热疗组、阿霉素联合PD-L1抗体组、热疗联合PD-L1抗体组、阿霉素联合热疗和PD-L1抗体组。其中对照组未予任何干预；阿霉素浓度选用IC50(4mg/L)；热疗采用电热恒温水浴箱加热1h，温度为43 ℃；PD-L1抗体浓度1.5mg/L。

1.4.4 细胞增殖抑制率检测 各组于干预48h加入CCK-8试剂10μL/孔，酶标仪450nm处测定各孔OD值，参比波长为650nm。计算各组细胞增殖抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

1.5 流式细胞术检测U251细胞表面PD-L1的表达

1.5.1 细胞分组U251细胞(2×104/孔)接种于96孔板，细胞分为未干预组、阿霉素单药组、单一热疗组、阿霉素单药联合热疗组。

1.5.2PD-L1表达检测 各组作用48h后，胰酶消化处理，PE-PD-L1抗体避光孵育30min，PBS洗2次，上流式细胞仪检测细胞表面PD-L1的表达。

1.6 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件处理数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 阿霉素对胶质瘤细胞U251的IC50 采用不同浓度阿霉素作用于U251细胞，48h后观察阿霉素对细胞增殖的影响，可见呈浓度依赖性，曲线呈反“S”形，IC50 的阿霉素浓度为4.298mg/L，后期实验取4mg/L。

2.2 各组细胞48h增殖抑制率的比较 阿霉素单药、PD-L1抗体单药以及单独应用热疗组对U251细胞均有增殖抑制作用；联合用药组较单药组增殖抑制更为明显(P<0.05)；在联合组中，阿霉素+热疗+PD-L1抗体组的增殖抑制作用最强，达(92.2±4.5)%，提示三者有明显协同作用。见表1。

表1 作用于U251细胞48 h后不同处理组细胞增殖抑制率比较Table 1 Cell proliferation inhibition rate of U251 cells after different treatment

*P<0.05与阿霉素单药组比较 #P<0.05与热疗组比较 △P<0.05与PD-L1抗体组比较 ☆P<0.05与阿霉素+PD-L1抗体组比较 ▲P<0.05与阿霉素+热疗组比较 ★P<0.05与热疗+PD-L1抗体组比较(SNK-q检验)

2.3 各组细胞表面PD-L1的表达 未干预组PD-L1表达率为(65±8)%，阿霉素单药作用后PD-L1表达率更加增高，阿霉素联合热疗也可明显上调PD-L1表达(P<0.05)；而单一热疗对PD-L1的表达影响不大(P>0.05)。见表2。

表2 处理后各组细胞表面PD-L1表达比较Table 2 The expression of PD-L1 after different treatment

*P<0.05与未干预组比较 #P<0.05与阿霉素单药组比较(SNK-q检验)

3 讨 论

胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤之一。近年来，以手术、放疗、化疗和靶向治疗为主的综合治疗均取得了一定进展，但胶质瘤患者的长期生存率仍然较低。研究发现，肿瘤细胞可通过免疫耐受和逃逸机制使得自身免受宿主防御机制的杀伤和清除，其中PD-L1与PD-1相互作用介导的负性协同刺激信号在肿瘤的免疫逃逸中发挥了至关重要的作用。PD-L1广泛表达于多种肿瘤细胞，当受体与配体结合可抑制下游NF-κB的转录并促使干扰素-δ分泌的下调，最终抑制T细胞免疫，导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤。而阻断PD-1/PD-L1信号通路可以逆转肿瘤免疫微环境，恢复T细胞的抗肿瘤活性，从而增强内源性抗肿瘤免疫效应[11]。目前，美国FDA批准了2个具有划时代意义的免疫治疗药物：针对PD-1的抗体Nivolizumab和Pembrolizumab，用于黑色素瘤和晚期非小细胞肺癌治疗。针对PD-L1的抗体MPDL3280A在肺癌、黑色素瘤等临床研究中也取得了可喜的成绩[12-13]。免疫检查点抑制剂的出现改写了肿瘤治疗的历史，将肿瘤的药物治疗向前推进了一大步。这些成功的临床案例为免疫检查点抑制剂在胶质瘤中的应用提供了实践基础。尽管免疫检查点抑制剂(抗PD-1、PD-L1单抗)在肿瘤药物治疗中取得了重大进展，但目前临床上仍然面对两大亟待解决的问题：①肿瘤患者的获益人群仍然是有限的；②不能根治肿瘤，不能带来彻底的临床疗效。对于前者，已经进行了大量的相关性因素分析，研究认为PD-L1高表达的患者其临床获益率更高；对于后者，原因复杂，可能与表观遗传学的改变、免疫基因突变等因素有关。为了进一步使免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中发挥更大的作用，很多学者开始探索免疫治疗联合其他传统治疗方法的新策略，以期进一步增大获益人群、延长患者生存期[14-15]。

化疗是肿瘤治疗的重要手段之一，细胞毒性化疗药物能够改变肿瘤微环境的免疫抑制情况。环磷酰胺能够耗竭抑制性地调节T细胞，使用该药能够提高免疫反应。此外，其他一些化疗药物，如5-氟尿嘧啶、吉西他滨、紫杉类药物能够降低骨髓来源的抑制性细胞的数量。阿霉素是临床上常用的化疗药物，有研究显示阿霉素联合抗PD-1和CTLA-4 抗体可以增强抗肿瘤效果[16]。目前已经开始进行免疫治疗联合化疗或双免疫治疗联合治疗肺癌的临床研究，初步结果显示联合组有更好的治疗效果，高级别不良反应事件虽然增加，但可以控制，并且未出现治疗相关死亡事件[17]。因此，化疗联合PD-L1抑制剂有可能存在协同抗肿瘤作用。肿瘤热疗是通过物理方法将组织加热治疗肿瘤，现已成为继手术、放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗之后的又一类治疗手段。肿瘤热疗是泛指用加热来治疗肿瘤的一类治疗方法。在治疗晚期肺癌患者时，热化疗联合白细胞介素2可以很好地控制胸腔积液[18]。体外高频热疗配合体内γ刀和化疗联合治疗晚期肺癌显示出了更好的疗效[19]。联合应用热疗与化疗即热化疗，可以提高肿瘤区域的药物浓度，同时降低正常组织的毒性作用，是为增效减毒。同时热疗可以使大量肿瘤抗原暴露，激活机体免疫功能，增强T细胞杀伤活性[20-21]。基于这些理论以及实践基础，本研究合理联合3种治疗手段，探究对胶质瘤细胞的杀伤效应，其联合抗肿瘤的具体机制如下：①PD-L1抑制剂阻断PD-1/PD-L1信号通路可以逆转肿瘤免疫微环境，恢复T细胞的抗肿瘤活性，从而增强内源性抗肿瘤免疫效应；②化疗是晚期肿瘤治疗基石，可直接有效降低瘤负荷，通过肿瘤坏死暴露新抗原，还可以上调PD-L1，从而可以联合PD-L1单抗的免疫治疗；③热疗直接杀死肿瘤的同时也可暴露肿瘤抗原；④热疗可以使肿瘤局部升温，增加化疗药物的局部富集。本研究结果显示，与单一方法治疗相比，三者联合抑制肿瘤细胞增殖的能力最强。提示3种方法联合治疗胶质瘤可能成为神经胶质瘤新的联合治疗模式。

目前认为PD-L1高表达与使用PD-1/PD-L1患者的临床获益呈正相关。Berghoff等[22]对135例神经胶质瘤的标本检测中发现，原发胶质瘤的PD-L1表达率达88%，继发胶质瘤的PD-L1表达率达72%，胶质瘤的PD-L1表达率比其他肿瘤高。本研究对处理前后的肿瘤细胞PD-L1的表达进行检测，结果显示阿霉素可以提高PD-L1的表达，阿霉素联合热疗更明显提高PD-L1的表达。因此，阿霉素可能通过上调PD-L1的表达增敏PD-L1抗体抗肿瘤作用。

综上所述，阿霉素化疗联合热疗、PD-L1抗体免疫治疗可以协同抗肿瘤细胞增殖，为胶质瘤的治疗提供新的思路。但本研究仍存在不足之处，如细胞株种类少、机制探究不够深入。未来，尚需要大量的基础研究和临床研究对其效果加以证实。

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(本文编辑：许卓文)

Effectsofadriamycincombinedwiththermotherapyandimmunotherapyongliomacells

ZHANGHai-feng1，ZHENGShi-ya2，OUYANGBin1,YANGDeng-yuan1,LIUWen-qing3，TIANJi-hui3*

(1.DepartmentofSurgery,NanjingCenterHospital,JiangsuProvince,Nanjing210000,China; 2.DpeartmentofOncology,MedicalSchoolofSoutheastUniversity，Nanjing210000,China; 3.DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

ObjectiveTo observe the effect of adriamycin combined with thermotherapy and anti-programmed cell death ligand-1(PD-L1) antibodies on cell proliferation in U251 glioma cells, and to explore the expression of PD-L1 of U251 glioma cells after being treated with adriamycin and/or thermotherapy.MethodsIC50 of adriamycin for U251 cells was determined by CCK-8 assay. The U251 cells were divided into several groups according to different treatments, then the viability of cells were measured by CCK-8 assay. The expression of PD-L1 on the surface of U251 cells was determined by flow cytometry after treated with adriamycin and/or thermotherapy.ResultsAdriamycin combined with thermotherapy and anti-PD-L1 antibodies could inhibit glioma cells growth obviously compared with other groups. Adriamycin combined with thermotherapy could up-regulate the expression of PD-L1.ConclusionAdriamycin combined with thermotherapy and anti-PD-L1 antibodies is a promising treatment regime for glioma and our research provides theoretical basis for the combination of adriamycin, thermotherapy and immunotherapy in glioma treatment.

glioma;immunotherapy;thermotherapy；adriamycin

R730.264

A

1007-3205(2017)10-1144-04

2017-01-03；

2017-02-04

张海峰(1988-)，男，山东泰安人，江苏省南京市中心医院住院医师，医学硕士，从事胶质瘤诊治研究。

*通讯作者。E-mail:nxtjh1968@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.10.007