不同分子生物学方法在手足口病标本检测中的应用

张龙，袁青，郑雅萍

（浙江省金华市中心医院 检验科，浙江 金华 321000）

不同分子生物学方法在手足口病标本检测中的应用

张龙，袁青，郑雅萍

（浙江省金华市中心医院 检验科，浙江 金华 321000）

目的探究分析不同分子生物学方法在手足口病标本检测中的应用效果。方法随机选取我院2014年1月至2016年1月收集的120份手足口病标本为研究对象，分别根据不同分子生物法，将其分为实时RTPCRZ组﹑一步法RT-PCRZ组﹑巢式PCR组进行检测，比较分析三种方法检测肠道71型（EV71）敏感性。结果实时RT-PCR法与巢式PCR手足口病检测率明显高于与一步法RT-PCR法（P＜0.05）。结论RT-PCR法与巢式PCR法在手足口病检测方面的检测准确性较高，值得临床应用。

手足口病；PCR；一步法；阳性率

0 引言

手足口病（HFMD）是临床诊疗中较为常见的小儿传染性疾病，主要发病人群是5岁以下儿童，其病原体主要为科萨奇病毒A组16型，及肠道病毒71型[1]。目前，临床上呢尚未出现有效针对治疗药物，因此，早期诊断手足口病是提高治疗效果的关键[2-3]。随着生物医疗研究发展的不断深入，不同分子生物学方法在临床上的应用也更加普遍。鉴于此，本研究在手足口病标本检测中采用分子生物学。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究所选120例研究标本均来自于我院住院患儿，所有患儿入院时间为2014年1月至2016年1月。所有患儿均经临床诊断确诊，符合手足口病诊断标准，具有发热﹑口腔溃疡﹑皮疹等临床症状表现，并伴有不同程度中枢神经系统症状[4]。120例患儿中30例需要住院，70例属于病情较轻的患儿，20例患儿病情较重，男女患者分别65例﹑55例，年龄8个月至5岁，平均年龄为（3.1±1.5）岁。所有患儿所采集标本均采用不同生物分子方法进行检测。

1.2 检测方法

所有手足口病标本均取自120例患儿，标本采集过程中严格遵循无菌操作，将收集到的患儿粪便放置在无菌密封的大便盒中。采用医用棉签在患儿扁桃体及咽后壁擦拭，收集咽喉部位的样本，并将所用棉签放在3mL Hank采样管中保存，为了确保标本的完好保存，将所得标本放置在-80℃冰箱内进行保存待用。然后，分别用实时RT-PCRZ法﹑一步法RT-PCRZ﹑巢式PCR法检测所有标本。PCR扩增仪及试剂盒均购自Promega公司，将温度调至45℃并进行逆转录处理45min，然后将温度控制在94℃，实施预变性处理2min，经20s变性处理后，退火处理应控制在45℃条件下，延伸温度71℃条件下，时间为30s，共进行36个循环。最后，分析三组检测结果。

表1 手足口病阳性结果（n，%）

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0统计学软件，P＜0.05表示数据有统计学意义。

2 结果

在实时RT-PCR组，重死患儿﹑轻症患儿以及住院患儿标本阳性率检测结果分别为80%﹑22.9%﹑80%。在一步法RT-PCR组中，重死患儿﹑轻症患儿以及住院患儿标本阳性率检测结果分别为45%﹑8.6%﹑16.7%。在巢式PCR组中，重死患儿﹑轻症患儿以及住院患儿标本阳性率检测结果分别为85%﹑25.7%﹑86.7%。各组检测阳性率比较具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

3 讨论

手足口病在儿童医疗诊治中具有较高的发病率，是临床医疗诊治中较为常见的出疹性疾病，以人肠道病毒属﹑微小核糖核酸病毒等病原为主，临床发病率较高[5-7]。由于患儿体制较弱，各项免疫系统发展还不完善，一旦出现手足口病，将在一定程度上影响患儿健康成长，需要早发现早治疗。因此，临床检测手足口病标本病原体可以临床病例治疗中提供相关指导价值。陈竞[8]等人通过对逆转录（RT）-聚合酶链反应（PCR）以及巢式PCR进行检测结果比较，结果显示，逆转录-聚合酶链反应对两种病毒的检测分别是EV71为79例（38.9%），CAV16为 48例（23.6%）;巢 式 PCR监测方法是EV71为145例（71.5%），CAV16为59例（29.1%）说明巢式PCR在CAV16及EV71检测中的应用价值更高，其灵敏度也相对较高。其中，实时RT-PCR需要在规定的时间内完成，病原体阳性分析结果在合理的时间内结果较为准确[9]。一步法RT-PCR指的是在逆转录条件下，实施DNA扩增，并进行临床分析[10]。巢式 PCR法需要与模板结合制作引物，并在引物的作用下完成扩增，进而实施病原体分析[11-12]。在本次研究中，实时RT-PCR检测阳性率与一步法RTPCR﹑巢式PCR比较存在一定差异，前者检测效果更为灵敏，检测结果与以往研究报告[5]一致。

综上所述，相对于一步法RT-PCR﹑巢式PCR，实时RT-PCR操作简便，且在手足口病标本检测中的准确率较高，因此，可将实时RTPCR﹑巢式PCR作为小儿手足口病检测中的重要方式，值得深入探究。

[1] 关桂英,王风朝.不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用分析[J].当代医学,2014,20(22):133-134.

[2] 黄薇,孟建彤,杨才彬,等.手足口病重症死亡1例病原分子生物学分析[J].预防医学情报杂志,2012,28(1):15-19.

[3] 张少红,孟庆敏,孟敏芝,等.佳木斯地区2009年1-8月手足口病病原体检测分析[J].职业与健康,2010,26(7):792-793.

[4] 林裕龙,温坤,潘玉先,等.一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒[J].临床检验杂志, 2010, 28(3):169-171.

[5] 符宗敏,夏晓玲,赵琳,等.2011年昆明市手足口病病原检测及临床特征分析[J].临床儿科杂志,2013,31(1):48-51.

[6] 陈创.不同分子生物学方法检测手足口病标本的比较[J].辽宁医学院学报,2016, 37(4):21-22.

[7] 阎岩,王定明,胡静,等.三种分子生物学方法诊断手足口病的比较[J].贵州医药,2011,35(2):107-109.

[8] 陈竞,蔡燕.手足口病的分子生物学监测[J].医药前沿,2012,02(3):229.

[9] 冀林立.实时荧光RT-PCR法与常规RT-PCR法检测手足口病病原体的比较[J].中国卫生检验杂志,2016,4(5):680-682.

[10] 粘志光.不同分子生物学方法检测手足口病标本的应用研究[J].中国卫生产业,2016,13(16):105-107.

[11] 白丽娜,王冰,王萍,等.2015年沈阳地区手足口病监测结果分析[J].中国卫生检验杂志, 2016,2(20):2980-2981.

[12] 潘红波,黄璐,陆玉坤,等.手足口病特异性微小RNA-143靶基因预测和生物信息学分析[J].医药前沿,2016, 6(18):239-240.

Application of Different Molecular Biological Methods in Detection of Hand,Foot and Mouth Disease

ZHANG Long, YUAN Qing, ZHENG Ya-ping
(Department of Clinical Laboratory, Jinhua City Central Hospital of Zhejiang, Jinhua, Zhejiang, 321000)

ObjectiveTo investigate and analyze application effect of different molecular biological methods in detection of hand, foot and mouth disease.MethodsChoose 120 cases HFMD collected in our hospital from January 2014 to January 2016 randomly as research objects, according to different molecular biological methods, divide them into real-time RTPCRZ group, on step method RT-PCRZ group, nested PCR group respectively for detection, compare and analyze sensitivity detecting enterovirus 71 type (EV71) of three methods.ResultsHFMD detection rate of real-time RT-PCR and nested PCR was significantly higher than one-step RT-PCR method (P＜0.05).ConclusionRT-PCR and nested PCR method has higher accuracy in detecting HFMD disease, which is worthy of clinical promotion and application.

Hand foot mouth disease; PCR; One step method; Positive rate

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.12.038