抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性及理化性质

樊艳平 张耀文 赵雪英 张仙红,*山西农业大学农学院, 山西太谷03080;山西省农业科学院作物科学研究所, 山西太原030000

抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性及理化性质

樊艳平1张耀文2赵雪英2张仙红1,*1山西农业大学农学院, 山西太谷030801;2山西省农业科学院作物科学研究所, 山西太原030000

以4个抗豆象绿豆品系B18、B20、B24和A22为试材, 以感虫绿豆品种晋绿1号为对照, 研究了不同绿豆中胰蛋白酶抑制剂活性及其在高温、酸碱及超声波下绿豆的胰蛋白酶抑制剂稳定性。结果表明, 4个抗豆象绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性均显著高于对照感虫品种, 且均与对照在0.01水平差异极显著, 其中B18活性最高, 高达70.2 TI U g–1, B20和A22活性次之, B24活性最差, 但仍高达55.2 TI U g–1。4个抗豆象绿豆品种在不同温度、不同pH和不同振幅超声波下, 残余活性均比对照高, 且残余活性均随温度升高、温浴时间延长而降低, pH在2～12之间, 随pH值的升高, 残余活性均呈现先升高后降低的趋势, 且pH值为6～8之间残余活性最高, 残余活性也随超声波辐射强度升高、时间延长而降低, 且4个抗虫品种中B18的耐高温性、耐酸碱性和耐辐射性最强, B20次之, B24的耐高温性、耐酸碱性最差, A22耐辐射性最差, 说明在不同温度、pH和超声波处理后, B18、B20是抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂残余活性保存最高的2个品种, 应用价值较大。

抗豆象绿豆; 胰蛋白酶抑制剂; 活性; 温度; pH; 超声波

Abstract:Taking bruchid-resistant mung bean lines including B18, B20, B24, and A22 as experimental materials, a susceptible variety mung bean Jinlyu 1 as control, the activity of trypsin inhibitor and the stability of mung bean trypsin inhibitor under high temperature, pH and ultrasonic were measured. The trypsin inhibitor activities of four bruchid-resistant mung bean lines were significantly higher than those of control (Jinlyu 1). There were significant differences of trypsin inhibitor activity between four bruchid-resistant mung bean lines and the control at the 1% probability level. Among them, B18 had the highest activity (70.2 TI U g–1), following by B20 and A22, and B24 had the lowest one (55.2 TI U g–1). When treated with temperature, pH and amplitude of ultrasonic, the residual activities of trypsin inhibitor from the four bruchid-resistant mung bean lines were higher than those of control. The residual activities decreased with the increase of temperature and time of warm bath, which enhanced initially and then weakened when pH value was elevating between 2–12, with the highest when pH ranged from six to eight. The residual activities also reduced with the increasing ultrasonic intensity and treatment time. Among the four tested lines, B18 had the highest tolerance to high temperature, high acid and alkali stress, and ultrasonic intensity; B20 had the moderate tolerance, B24 had the lowest tolerance to high temperature, acid and alkali stress, while A22 had the lowest tolerance to ultrasonic treatment. We concluded that among four lines, B18 and B20 have the highest residual activity of bruchid-resistant mung bean trypsin inhibitor under temperature, pH and ultrasonic treatments, being of higher value of its application.

Keywords:Bruchid-resistant mung bean; Trypsin inhibitor; Activity; Temperature; pH; Ultrasonic

胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor, TI)普遍存在 于种子和块茎等植物的储藏器官中, 在豆类作物种子中含量较高[1-3]。它能在生物体内与胰蛋白酶结合形成一类不可逆的无酶活性的复合物, 从而抑制生物对蛋白质的消化、吸收和利用。胰蛋白酶抑制剂作为一种抗营养因子, 可与昆虫肠道中的胰蛋白酶结合形成稳定的复合物而影响昆虫对食物的消化和吸收; 同时, 胰蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶形成的复合物还可能作为一个负反馈信号抑制昆虫的取食,这种双重效应有效地降低了害虫对食物蛋白的消化利用[4-7]。此外, 胰蛋白酶抑制剂还具有抗病毒、抗癌的作用, 据报道, 自豆类中提取的 Kunitz型和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂可抑制HIV-1病毒增殖的反转录酶的活性, 从而抑制 HIV-1病毒的增殖[8]; 自蚕豆中提取的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂, 不仅可以抑制HIV-1反转录酶活性, 同时具有通过诱导染色质凝聚和细胞凋亡而抑制 HepG2肝肿瘤细胞增殖的能力[9]。此外, 大豆的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂对卵巢癌、宫颈癌及肠癌等多种肿瘤表现明显的抗癌活性[10-12]; 北海道黑豆的 Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂对乳房癌细胞增殖有明显的抑制[13];荞麦胰蛋白酶抑制剂可通过诱导实体癌细胞凋亡发挥抗癌作用[14-16]。因此, 目前胰蛋白酶抑制剂被广泛应用于医药、农业、食品和生物工程等领域[17-19]。

绿豆胰蛋白酶抑制剂的研究始于20世纪60年代[20-21], 属 Bowman-Birk类抑制剂, 其 2个活性中心Lys和Arg可分别抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性[22], 因此被认为是自然界里胰蛋白酶最有效的抑制剂之一[23]。目前, 许多学者已对绿豆胰蛋白酶抑制剂分离纯化技术进行了研究[24-28], 其LysGP33活性片段抑制人结肠癌 SW480细胞的迁移[29]及对Kexin和Furin蛋白前体加工酶的抑制活性也得到了证实[23], 此外, 绿豆胰蛋白酶抑制剂对人肺腺癌A549细胞增殖和细胞凋亡也有明显抑制作用[30], 但对其生物学活性研究较少。抗虫害是胰蛋白酶抑制剂具有的生物功能之一, 那么抗虫绿豆中胰蛋白酶抑制剂活性会不会高于感虫品种, 其活性是否稳定？目前这方面的研究还未见报道。为此本试验以4个不同的抗虫绿豆为材料, 进行了绿豆品种中胰蛋白酶抑制剂活性测定及在高温、酸碱及超声波作用下其稳定性的研究, 旨在为抗虫绿豆资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试绿豆

选用高抗豆象绿豆品系A22、B18、B20和B24及普通绿豆品种晋绿1号, 以普通绿豆晋绿1号为对照, 均由山西省农业科学院作物科学研究所提供。

1.2 供试试剂及仪器

胰蛋白酶购自 Sigma公司; 苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐(BAPNA)、盐酸、Tris碱为分析纯乙酸。

粉碎机购自北京科技有限公司; 恒温水浴锅购自北京永光明医疗仪器厂; 离心机购自美国 Sigma公司; 天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司;酶标仪购自美国DANAHER公司; 摇床购自上海长城生化厂; 超声波处理器购自美国Branson公司; 移液枪购自德国Eppendorf公司。

1.3 胰蛋白酶抑制剂的提取

用多功能食品粉碎机粉碎绿豆并通过孔径 140 μm筛, 称取过筛样品20 g溶于20 mL蒸馏水, 于4℃振荡过夜, 振荡速度为 180 r min–1, 以 2000 × g 离心 15 min, 将所得沉淀(i)再次溶于等量蒸馏水重复以上操作, 合并 2次上清液为(I), 用磁力搅拌器缓慢搅拌, 缓慢加入研细的无水 CaCl2, 使 CaCl2最终浓度达到0.0375 mol L–1, 蛋白质形成较大颗粒沉淀后立即停止搅拌, 静置20 min, 5000 × g离心15 min,得到上清液(II)和沉淀(ii)。将沉淀(ii)用蒸馏水复溶、二次提取后, 同样以5000 × g离心15 min, 得到上清液(III)和沉淀(iii)。重复以上操作得到上清液(IV)和沉淀(iv), 合并上清液备用。

1.4 胰蛋白酶抑制剂活性的测定

取上述提取液0.1 mL加5 mg mL–1胰蛋白酶溶液0.1 mL与0.05 mol L–1Tris-HCl缓冲液(pH 8.1) 0.6 mL, 混匀后置37℃水浴10 min, 加底物BNPNA 1.0 mL, 于 37℃水浴 10 min, 最后加 30%乙酸 0.5 mL终止反应, 410 nm测吸光度, 计算抑制剂的活性[31]。

在上述反应条件下抑制 1 mg (1∶250)胰蛋白酶活性所需要的抑制剂量为 1个抑制剂活性单位(TI U)。

1.5 温度对胰蛋白酶抑制剂活性的影响

取 0.5 mL提取液置带螺旋盖的菌种冷冻管中,加入0.5 mL蒸馏水, 拧紧盖子, 分别在40℃、60℃、80℃、100℃恒温水浴处理30 min和60 min, 取出后立即置冰上冷却 15 min, 终止反应后离心, 取上清液按前述方法计算抑制剂的残余活性。

1.6 pH对胰蛋白酶抑制剂活性的影响

取 0.05 mol L–1pH 2、pH 4、pH 6、pH 8、pH 10、pH 12的缓冲液0.5 mL分别于离心管(其中pH 2和pH 4为柠檬酸缓冲液, pH 6、pH 8、pH 10和pH1 2为Tris-HCl缓冲液), 再分别加0.5 mL提取液于每种缓冲液, 混匀后37℃静置8 h。取上清液按前述方法计算抑制剂的残余活性。

（40）吾知此地造析天會，方從無間來赴之。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經註》卷六，《中华道藏》30/579）

1.7 超声波对胰蛋白酶抑制剂活性的影响

用吸管吸取 5 mL待测液放入一个特殊的玻璃容器中(能通过循环冷水保持周围温度在 25±3℃,减少对 TI的热效应), 把玻璃容器放进超声波处理器, 使锥形探头伸进样品溶液中。以振幅25%、35%、45%、55%和65%分别处理5、10、15和20 min来检测超声波处理下抑制剂的残余活性[32]。

1.8 数据分析

试验中胰蛋白酶抑制剂活性测定3次重复, 以其平均值±标准差来表示。采用Microsoft Excel处理数据, 用SPS 16.0软件统计和分析数据。

2 结果与分析

2.1 不同抗豆象绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性比较

由表1可知, 4个抗豆象绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性均显著高于对照, 且与对照在 0.01水平差异极显著, 4个抗虫品种间B18分别与A22、B20和B24在0.01水平差异极显著, B20和B24在0.01水平差异极显著, 其中B18活性最高, 达70.2 TI U g–1, 为对照的1.65倍, B20和A22次之, 分别达62.5 TI U g–1和 60.1 TI U g–1, 分别是对照的 1.47 倍和 1.41 倍,B24活性最低, 为55.2 TI U g–1, 仍为对照的1.30倍,4个抗虫品种间胰蛋白酶抑制剂活性差异较大, 高低相差1.27倍。

表1 不同抗豆象绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性比较Table 1 TI activity of different bruchid-resistant mung bean varieties

2.2 温度对抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性的影响

由表 2可知, 不同温度不同温浴时间对各供试绿豆胰蛋白酶抑制剂活性的影响不同, 参试品种的抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂残余活性有随温度升高、温浴时间延长而降低的趋势, 在 40℃时, 分别温浴30 min、60 min各绿豆胰蛋白酶抑制剂残余活性均在 90%以上, 说明低温下温浴时间对残余活性的影响很小, 但随温度升高, 温浴时间延长, 各绿豆品种活性均降低, 而 B18、B20在 100℃温浴 60 min残余活性仍比对照分别高 21.0%和 14.7%, B24活性最低, 仅比对照高 7.5%。在各温度处理下, 抗虫绿豆B18和B20的胰蛋白酶抑制剂均有较高的残余活性, 且均与对照差异显著, 说明 B18的耐高温性最强, B20次之, B24最差。各绿豆品种在各温度处理下变异系数在0.035～0.082之间, 其中100℃下温浴30 min变异系数要比其他各处理均大, 说明温度为100℃温浴30 min对各绿豆品种活性的影响较大。同时对测定结果作均数间的多重比较(表3)表明,在各温度处理下, 4个抗虫品种 TI活性均值均高于对照, 且 4个抗虫品种之间及与对照之间均在 0.01水平差异极显著, B18的TI活性均值明显高于其他3个抗虫品种。而不同温浴时间、不同温度处理下TI活性均值也均在 0.01水平差异极显著, 且温浴 30 min比温浴60 min TI活性的均值要高, 40℃的温度处理比其他温度处理TI活性的均值也高一些, 说明较短的温浴时间和低温对TI活性的影响较小, 相反较长的温浴时间和高温对TI活性的影响较大。

2.3 pH对抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性的影响

表4表明, 在pH 2～12范围内, 参试品种的抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂残余活性随 pH值的升高,呈现先升高后降低的趋势, 在各pH处理下, 4个抗虫品种中B18和B20均有较高的残余活性, 且均与对照差异显著, 当pH为2时, 分别比对照高27.0%和17.4%, 此外, B18在pH为12时残余活性为对照的2.81倍, 说明B18耐酸碱性均很强, B20次之, B24最差。当pH值为6～8时, 对供试各绿豆胰蛋白酶抑制剂活性影响较小。供试各绿豆品种在pH 12下变异系数比其他各处理均大, 说明偏碱性环境对各绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性的影响较大。对测定结果作均数间的多重比较(表5)表明, 在各pH处理下,4个抗虫品种TI活性均值均高于对照, 且4个抗虫同一列数据后不同字母表示在0.05水平上差异显著。

表2 温度对抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性的影响Table 2 Effect of temperature on TI activity in bruchid-resistant mung bean

表3 对不同绿豆品种和不同温度处理下TI活性作均数间的多重比较Table 3 Multiple comparisons of TI activity in different mung bean varieties and different temperatures

表4 pH对抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性的影响Table 4 Effect of pH on TI activity in bruchid-resistant mung bean

表5 对不同绿豆品种和不同pH处理下TI活性作均数间的多重比较Tab 5 Multiple comparisons of TI activity in different mungbean varieties and different pH values

2.4 超声波钝化对抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性的影响

由表 6可知, 不同振幅不同处理时间的超声波对各供试绿豆胰蛋白酶抑制剂活性的影响不同。参试品种的抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂残余活性有随超声波辐射强度升高、时间延长而降低的趋势, 在较低振幅短时间处理下, 4个抗虫品种均保持较高的残余活性, 说明低振幅对活性的影响较小, 但随振幅增加、处理时间延长, 残余活性均有所降低, 各绿豆品种在各振幅处理下变异系数在 0.035～0.133之间, 其中65%的振幅下处理20 min变异系数均大于其他各处理, 说明较高的振幅处理下, 时间越长对各绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性的影响越大, 但B18、B20在65%的振幅下处理20 min, 残余活性仍比对照分别高48.4%和30.2%。在各振幅处理下, B18和 B20均有较高的残余活性, 且均与对照有显著差异, 说明B18的耐辐射性最强, B20次之, A22最差。同时对测定结果作均数间的多重比较(表7)表明, 在各振幅处理下, 4个抗虫品种 TI活性均值均高于对照, 且 4个抗虫品种之间以及与对照之间均在 0.01水平差异极显著, B18的TI活性均值明显高于其他3个抗虫品种。而不同振幅、不同辐射时间下TI活性均值也均在α=0.01水平差异极显著, 且5 min的辐射时间比其他辐射时间 TI活性均值要高一些, 及25%的振幅处理要比其他振幅处理的TI活性均值高一些, 说明较短的辐射时间和低振幅对TI活性的影响较小, 相反较长的辐射时间和高振幅对TI活性的影响较大。

从表1、表2、表4和表6的分析可知, 参试品种在不同温度、pH和超声波处理后, B18、B20是抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性保存最高的2个品种,可见抗虫品种B18胰蛋白酶抑制剂的耐高温性、耐酸碱性和耐辐射性均最强, B20次之, B24的耐高温性、耐酸碱性最差, A22耐辐射性最差, 说明B18、B20是生产TI的潜在原料, 即B18、B20中的TI实际应用价值更大。

3 讨论

据报道, TI含量与植物品种、生理状态及受病虫侵害程度有一定关系[33], 我国不同产地的26个绿豆品种 TI活性为 29.0～53.5 TI U g–1[34]。本试验表明, 4个抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂活性均显著高于感虫品种及江均平的报道结果。研究表明, TI对丝氨酸蛋白酶具有广谱的抑制作用, 可与胰蛋白酶和胰凝乳酶等消化酶结合而使其失活, 从而治疗由于消化酶过多而对胰腺造成损伤的胰腺炎[35]; 此外, 绿豆胰蛋白酶抑制剂可有效抵制人肺腺癌 A549细胞增殖和细胞凋亡[30], 其LysGP33活性片段能够有效抑制人结肠癌SW480细胞的迁移[29], 抗虫绿豆B18和B20中TI含量均较高, 因此绿豆B18、B20有望作为生产TI的潜在原料而用于治疗人类疾病。

试验表明, 供试抗虫绿豆B18、B20的TI活性在 100℃加热 30 min后残余活性可高达 85.2%～88.5%, 而黑豆的TI活性在同等加热时间内90℃时则完全失活[25], 大豆的TI活性在温度高于80℃活性也急剧下降[36], 可见抗虫绿豆B18、B20较黑豆、大豆的 TI活性具有很强的耐热性, 这对于抗虫绿豆B18、B20的TI的开发利用具有非常重要的意义。

据邵彪等[25]报道, 黑豆TI经pH 2～12处理1 h,活性残存率均在80%以上; 大豆TI活性在pH 2～11条件下保存30 min, 其活性基本没有明显的变化[36];苦荞种子在pH 2～6的不同缓冲溶液中放置1 h 后,其抑制活性可保留80%左右, 在pH 12条件下, 抑制活性只保留约30%[26], 本研究中4个抗豆象绿豆在pH 2～12下保存8 h均有较高的残余活性, 可见抗虫

绿豆均具有较高的 pH耐受性, 且耐酸性要强于耐碱性。据报道, TI作为一种抗营养因子, 可与昆虫肠道中的胰蛋白酶结合形成稳定的复合物而影响昆虫对食物的消化和吸收[4-7], 可见抗虫绿豆中 TI可适用于肠中不同 pH的害虫的防治, 同时也可与不同酸碱性农药混合使用来控制害虫的为害。

表6 超声波钝化对抗豆象绿豆胰蛋白酶抑制剂活性的影响Table 6 Effect of ultrasonic inactivation on TI activity in bruchid-resistant mung bean

表7 对不同绿豆品种和不同振幅处理下TI活性作均数间的多重比较Table 7 Multiple comparisons of TI activity in different mung bean varieties and different amplitudes

超声波辐射对胰蛋白酶抑制剂活性影响的研究较少, Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制剂(KSTI)在65%振幅下随处理时间增加残余活性均快速下降[37], 苦荞麦的TI活性随超声波辐射强度升高、时间延长呈现降低的趋势[26], 和本研究的结果基本一致, 但 4个抗虫品种在65%振幅下处理20 min残余活性均高于大豆和苦荞麦。

研究表明, TI与内源抗虫物质协调作用可增加植物的抗虫性。目前, 至少有15种不同来源的TI基因转入不同植物, 获得具有不同抗性的转基因植株,如Hilder等[38]将豇豆TI基因转入烟草中, 获得了高抗棉铃虫、粘虫的转基因植株; 大麦、南瓜、马铃薯、番茄等TI基因转入烟草中获得抗棉铃虫的转基因烟草; 利用大豆Kunitz型TI基因也获得抗棉铃虫的转基因烟草、棉花、马铃薯等[39]。绿豆B18、B20种子中不仅TI活性高, 且耐高温、耐酸碱和耐辐射,因此如何科学使用抗虫绿豆B18、B20的TI基因需进一步深入研究。

4 结论

4个抗豆象绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性均显著高于对照感虫品种, 且在不同温度、pH和超声波处理后, 残余活性也均比对照感虫品种高, 其中,抗虫绿豆 B18胰蛋白酶抑制剂活性最高且耐高温性、耐酸碱性和耐辐射性均最强, B20次之, 可见绿豆B18、B20有望作为TI的潜在原料用于培育抗虫的转基因植株和治疗人类疾病。

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Activity and Physico Chemical Properties of Trypsin Inhibitor in Bruchid-Resistant Mung Bean

FAN Yan-Ping1, ZHANG Yao-Wen2, ZHAO Xue-Ying2, and ZHANG Xian-Hong1,*1College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China;2Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030000, China

10.3724/SP.J.1006.2017.01696

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(GARS-08-G11)资助。

The study was supported by the China Agriculture Research System (GARS-08-G11).

*通讯作者(Corresponding author): 张仙红, E-mail: zxh6288@sina.com

联系方式: E-mail: ndxxxy@126.com, Tel: 13485360715

): 2016-12-18; Accepted(接受日期): 2017-07-23; Published online(网络出版日期): 2017-08-10.URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170810.1616.008.html