利用SSR分子标记构建邯棉559、邯棉802和邯郸885的指纹图谱

2017-10-17付小琼杨保新杨付新刘逢举刘媛蔡家滨彭军

中国棉花 2017年9期

付小琼，杨保新，杨付新，刘逢举，刘媛，蔡家滨，彭军*

（1.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000；2.河北省邯郸市农业科学院，河北邯郸056001；3.山东省德州市德城区农业局，山东德州253000）

付小琼1，杨保新2，杨付新1，刘逢举1，刘媛1，蔡家滨3，彭军1*

为了保护国审品种邯棉559、邯棉802和河北省审定品种邯郸885的品种权，减少棉种企业的经营风险，保障棉农种上优质的棉花品种，选择了44对SSR核心引物构建邯棉559、邯棉802和邯郸885的指纹图谱。利用指纹图谱检测品种的真实性和纯度。这44对核心引物多态性好，鉴别能力强，广适性好。

邯棉 559；邯棉 802；邯郸 885；SSR；指纹图谱；纯度

近年来，随着分子生物学的发展，各种作物均采用了SSR分子标记构建了DNA的指纹图谱，许多育种家保护意识增强，在品种审定后构建了指纹图谱[1-6]。为保护育种者的品种权，保证品种的真实性和纯度，利用SSR分子标记构建棉花品种指纹图谱，用于品种的真实性和纯度鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

邯棉559、邯棉802和邯郸885均由邯郸市农业科学院育成，3个品种的种子均由邯郸市农业科学院提供。邯棉559于2008年通过国家审定，为中熟常规抗虫品种；邯棉802于2006年通过国家审定，为中早熟常规抗虫品种；邯郸885于2006年通过河北省审定，为中熟常规抗虫品种。这3个品种综合性状好，纤维品质均较优，符合当前对棉花纤维品质的要求。

1.2 方法

1.2.1 引物合成与试剂来源。SSR引物由上海生工合成，Taq酶、dNTPs等购自安阳科睿生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2.2 棉花基因组DNA的提取。2017年3月3个品种各取50粒种子置于生长箱（30℃）内发芽，发芽后7 d用子叶提取DNA。单株取样，每个品种随机取样24株，用MM 301研磨仪进行冷冻研磨，用CTAB法提取DNA[1]。

1.2.3 SSR-PCR扩增。PCR扩增体系：模板DNA 1 μL， Buffer（含 MgCl2）1 μL，dNTPs（10mmol·L－1）0.3 μL，正引物（10 μmol·L－1）0.5 μL，反引物（10 μmol·L－1）0.5 μL，Taq 酶（2.5 U·μL－1） 0.2 μL，ddH2O 6.5μL。PCR反应程序：94℃预变性3min；94 ℃变性 30 s、56 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 45 s，共30个循环；94℃变性 1m in、56℃退火 45 s、72℃延伸2m in；扩增产物于4℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳。扩增产物采用质量分数8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。每孔上样2 μL，220 V 电压 1.5 h。固定 10m in，渗透 12min，显色5m in，倒入终止液，终止反应[7]。

1.2.5 读带方法。每对引物在棉花品种中验证均具有多态性，绝大部分为3种带型，为了直观表示，作者一般将同一引物扩增图谱中依最小扩增产物的分子量大小来分类，当最小产物的分子量相同时以次二的分子量分类，依次类推。低分子量谱带的类型定义为1，高分子量谱带的类型定义为2，杂合共显带类型定义为3（图1）。本文中不涉及杂合共显带，各品种均为常规棉，个别引物的带型较为复杂，有三种以上的谱带，在此依低分子量到高分子量分别编为1、2和3。把相应的图谱类型转换成类似身份证号为独一无二的编码（表1）。用编码来区分品种的差异，与传统的有带读1、无带读0不同，读法简便、快速[3]。

图1 引物NAU2026在3个不同棉花品种中的扩增图谱

2 结果与分析

2.1 引物选择

从本单位经过大量棉花品种验证的190对SSR核心引物中，筛选出44对扩增稳定、条带清晰、多态性好的引物用于构建邯棉559、邯棉802和邯郸885的指纹图谱（表2）。

2.2 邯棉559、邯棉802和邯郸885纯度检测结果

利用多态性好的10对引物对3个品种做SSR标记纯度的检测。有1对以上引物的图谱不同于其他植株，视为杂株；一致的植株数占总检测株数的百分率为SSR标记纯度。3个品种纯度均较好（表3，图 2）。邯棉 559中有 1株杂株（图 2A，2B），邯棉802中有2株杂株（图2C，2D），邯郸885无杂株（图 2E，2F）。

表1 邯棉559、邯棉802和邯郸885对应的44对核心引物的图谱编码

图2 3个棉花品种的纯度检测

表3 邯棉559、邯棉802和邯郸885的SSR纯度检测结果

2.3 邯棉559、邯棉802和邯郸885的指纹图谱构建

在纯度检测的基础上，每个品种去除杂株后选择有代表性的2个单株，利用44对核心引物构建指纹图谱，各品种对应的部分引物的图谱见图3。

图3 邯棉559、邯棉802和邯郸885的SSR扩增图谱

在44对核心引物中（表1），有 9对引物的扩增条带在邯棉559、邯棉802和邯郸885品种间没有区别；有2对引物3个品种间各不相同，表明这3个品种的亲本有差异，用这2对引物能够有效区分这3个品种。邯棉559和邯郸885有23对引物扩增的图谱相同，相似度较大，这与2个品种均是以邯109为亲本有关。而邯棉559和邯棉802有7对引物谱带相同，邯棉802与邯郸885仅有3对引物谱带相同，差异较大，这可能是育种的亲本差异大，且邯棉802为中早熟品种，另2个品种为中熟品种，不同的选择方向导致品种间基因差异大。

3 讨论与结论

经多年国家级和省级棉花区试品种的室内测定和田间比对，SSR标记纯度相对于田间纯度要求更为严格导致纯度偏低，这是因为有区别的DNA区域可能为非编码区域，与表观性状无关；或者有区别的DNA区域与内在性状有关而与表观性状无关等[8-11]。但SSR标记纯度与田间纯度高度正相关，SSR标记纯度较好的品种，大田纯度均较好；SSR标记纯度差的品种，田间纯度肯定差。

利用44对核心引物构建了邯棉559、邯棉802和邯郸885的指纹图谱：一方面有利于育种者品种权的保护，有利于棉农种上真正的优质棉，保障棉农的利益；另一方面有利于棉种企业控制种子质量，减小经营风险。此外，利用这44对核心引物鉴别其他品种的效果也非常好[3]，在国家棉花区试和河南、河北省棉花区试参试品种的纯度鉴定中应用；因此，可以说这是1组广适性的引物，可以用于其他棉花品种的指纹图谱构建和纯度鉴定。一般的做法，纯度鉴定应用10～15对多态性引物，单株取样，在纯度鉴定的基础上去杂选择代表性植株做品种的指纹图谱。指纹图谱引物应用较多，一般应用40～50对多态性引物。在构建指纹图谱后鉴定真实性时应用一些该品种的特异性引物就行，减少了工作量。

品种指纹图谱的构建，不仅有利于品种权的保护，还有利于分析不同品种的亲缘关系，利用图谱的相似度大小选择育种亲本的配制，合理利用品种资源。

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