酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ检测方法的优化

2017-10-16,,,

食品工业科技 2017年18期

关键词：萃取柱氨水水溶液

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(江苏省泰州市食品药品检验所,江苏泰州 225300)

酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ检测方法的优化

冯寅洁,乔勇升,纪晨,陈伟

(江苏省泰州市食品药品检验所,江苏泰州225300)

优化了固相萃取-高效液相色谱检测酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ的方法。样品经过石油醚去油后,用氨水-乙醇-水溶液(体积比20∶70∶10)提取,70 ℃水浴浓缩,调节pH至5～6,通过Cleanert PWAX弱阴离子交换柱净化和富集,60 ℃水浴挥干洗脱液后用水溶解定容,借助Thermo Hypersil Gold C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)分离,20 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇(体积比35∶65)为流动相,以1 mL/min的流速等度洗脱。结果表明:酸性橙Ⅱ在0.1～5 μg/mL内线性良好,相关系数(r)大于0.99995,检出限为0.01 mg/kg。对鸭翅空白样品分别进行0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg四种水平的加标回收实验,酸性橙Ⅱ的加标回收率为80.8%～86.3%,相对标准偏差为2.1%～4.7%(n=6)。该方法去除了样品中的基质干扰,较好地提取了酸性橙Ⅱ,选用的固相萃取柱净化和富集效果理想,具有灵敏度高、可操作性强、重复性好、适用于批量检测等特点。

酱卤肉,酸性橙Ⅱ,固相萃取柱,高效液相色谱

Abstract:An optimized method was developed for the determination of acid orange Ⅱ in soy sauce and pot-roast meat products by HPLC-SPE. Samples were firstly removed oil by petroleum,extracted by ammonia-ethanol-water solution(20∶70∶10 of volume ratio),concentrated by water bath at 70 ℃,and adjusted pH value to 5～6. Then,the extraction was cleaned and enriched by Agela Cleanert WPAX weak anion exchange column. The elution was dried by water bath at 60 ℃ and dissolved with water to a constant volume. Sample solution were separated by Thermo Hypersil Gold C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with the mobile phase of 20 mmol/L ammonium acetate aqueous solution-methanol(35∶65 of volume ratio)at the flow rate of 1 mL/min.Results indicated a good linearity with the linear correlation coefficient(r)above 0.99995 in the range of 0.1～5 μg/mL and the detection limit was 0.01 mg/kg. Under the chosen experiment condition,the average recoveries at four spiked levels(0.5,1.0,1.5,2.0 mg/kg)were 80.8%～86.3% and the relative standard deviations(RSD)were 2.1%～4.7%(n=6). The method can remove sample’s matrix interference,better extracted acid orange Ⅱ,and has advantages such as high sensitivity,good operability and repeatability,which can be applied for the batch detection.

Keywords:soy sauce and pot-roast meat;acid orange Ⅱ;solid phase extraction column;high performance liquid chromatography

酸性橙Ⅱ化学名2-萘酚偶氮对苯磺酸钠,化学结构式如图1所示[1],它是一种常用的酸碱指示剂,同时也因其色泽鲜艳、着色稳定而应用于工业印染。有研究表明此种偶氮类染料具有致癌、致畸的风险[2-3],若将其加入食品中改善色泽,可能会危害食用者的健康。在食品整治办〔2008〕3号文——全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组关于印发《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》的通知中，将酸性橙Ⅱ列入可能违法添加的非食用物质名单,严禁将其作为着色剂添加到卤制熟食中。国家食品药品监管总局发布的《食品安全抽检实施细则(2016年版)》中明确要求酱卤肉制品必须检测酸性橙Ⅱ。

图1 酸性橙Ⅱ化学结构式Fig.1 Chemical structure of acid orange Ⅱ

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸭翅根、鸡块、鸡腿、野山椒凤爪、香卤猪唇、酱肉火腿均为真空包装,购于超市;酸性橙Ⅱ 纯度98.0%,德国Dr. Ehrenstorfer公司;甲醇色谱纯,美国Dikma公司;石油醚、甲酸、氨水、无水乙醇、柠檬酸均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;A柱:Cleanert PWAX混合型弱阴离子交换固相萃取柱(60 mg/3 mL) 天津博纳艾杰尔科技有限公司;B柱:Oasis WAX混合型弱阴离子交换固相萃取柱(60 mg/3 mL) 美国Waters公司;C柱:CNW poly-sery PWAX弱阴离子交换固相萃取柱(60 mg/3 mL) 上海安谱实验科技股份有限公司;D柱:Cleanert NH2氨基固相萃取柱(500 mg/3 mL) 天津博纳艾杰尔科技有限公司;E柱:Sep-Pak Vac NH2氨基固相萃取柱(500 mg/3 mL) 美国Waters公司;F柱:CNWBOND NH2氨基固相萃取柱(200 mg/3 mL) 上海安谱实验科技股份有限公司。

DIONEX UltiMate 3000高效液相色谱仪串联二极管阵列检测器美国Thermo Fisher Scientific公司;XS204电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司;Milli-Q Reference超纯水机美国Millipore公司;VORTEX 2旋涡混匀器德国IKA公司;JP-100结盟牌超声波清洗机深圳市结盟清洗设备有限公司;LD5-2B低速离心机北京雷勃尔医疗器械有限公司;HHS-6S电子恒温不锈钢水浴锅上海光地仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准工作溶液配制准确称取酸性橙Ⅱ标准品10 mg,用水溶解并定容至100 mL,配制成100 μg/mL的标准贮备液。用水稀释标准贮备液,配成浓度依次为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的标准工作液。

1.2.2 样品前处理称取粉碎并搅拌均匀的样品2 g于50 mL具塞离心管中,加入20 mL石油醚(沸程30～60 ℃),涡旋1 min后超声提取5 min,5000 r/min离心5 min,弃去上清液。加入20 mL氨水-乙醇-水提取溶液(体积比20∶70∶10),涡旋1 min后超声提取10 min,5000 r/min离心5 min,将上清液倒入小烧杯,重复提取残渣一次,合并上清液于烧杯中,将烧杯置于70 ℃水浴浓缩提取液至约10 mL,取少量水冲洗烧杯内壁,用20 g/L柠檬酸溶液调节提取液pH至5～6。将样品提取液加入已依次用3 mL甲醇、3 mL 2%甲酸水溶液活化的固相萃取柱中,待全部上样后用3 mL 2%甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗,负压抽干固相萃取柱,用6 mL 10%氨水甲醇溶液洗脱,收集洗脱液于烧杯中,将烧杯置于60 ℃水浴挥干,准确加入2 mL水溶解残渣,样品溶液过0.22 μm水系纤维素针式滤膜,待进样。

1.2.3 提取溶液的比较按照1.2.2处理样品,分别选用超纯水、乙醇-水溶液(体积比70∶30)、甲酸-乙醇-水溶液(体积比1∶70∶29)、氨水-乙醇-水溶液(体积比20∶70∶10)提取加标水平为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg的鸭翅样品,提取液经过浓缩、调节pH后通过Cleanert PWAX柱处理,经液相色谱检测比较不同提取溶液处理组的加标回收率。

1.2.4 浓缩条件的比较按照1.2.2处理样品,将氨水-乙醇-水溶液(体积比20∶70∶10)提取的样品提取液分别采用真空常温水浴旋蒸、常压60 ℃水浴加热、70 ℃水浴加热、80 ℃水浴加热的方法浓缩,比较不同浓缩条件下的液体挥发情况。

1.2.5 固相萃取柱的比较按照1.2.2处理样品,用氨水-乙醇-水溶液提取4个加标水平的鸭翅样品,提取液经过浓缩、调节pH后,分别借助A～F固相萃取柱净化和富集,经液相色谱检测比较不同固相萃取柱处理组的加标回收率。

1.2.6 液相色谱条件色谱柱:Thermo Hypersil Gold C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流动相:甲醇-20 mmol/L乙酸铵(体积比65∶35);流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL;二极管阵列检测器:检测波长484 nm,扫描波长190～800 nm。

1.3 数据处理

每个处理做6次平行。借助Thermo Scientific Dionex Chromeleon 7色谱数据系统对样品色谱图进行定性和定量分析,相同处理组数据通过Excel软件计算平均值和相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 检测波长确定

二极管阵列检测器采集酸性橙Ⅱ的190～800 nm光谱图,由图2可见,酸性橙Ⅱ因呈现鲜艳的金黄色,在可见光区484.90 nm有最大吸收;此外,200.85 nm和228.62 nm也有强吸收,为避免低波长段杂质吸收峰和溶剂峰的干扰,并且考虑到紫外检测器越接近末端吸收,基线越不平稳[13],确定检测波长为484 nm。

图2 酸性橙Ⅱ标准溶液光谱图Fig.2 Spectrum of acid orange Ⅱstandard solution

2.2 线性关系、检出限和重复性

将配制的标准工作液0.1～5 μg/mL按照浓度从低到高依次进样,其中0.5 μg/mL酸性橙Ⅱ溶液色谱图见图3。以标准溶液峰面积(mAu·min)Y对其浓度(μg/mL)X进行线性回归,得方程Y=0.4178X+0.0024,r=0.99998。酸性橙Ⅱ检出限(S/N=3)为0.01 mg/kg,低于SN/T 3536-2013的测定低限。重复进0.5 μg/mL标准溶液6次,保留时间平均为6.251 min,峰面积平均值为0.2165 mAu·min,RSD分别为0.1%和2.3%,定性和定量的重复性均较理想。

图3 酸性橙Ⅱ标准溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of acid orange Ⅱ standard solution

2.3 样品提取溶液的选择

比较图4各处理的加标回收率,提取效果为:氨水-乙醇-水溶液>乙醇-水溶液>甲酸-乙醇-水溶液>超纯水。其中,氨水-乙醇-水溶液处理组的平均回收率为80.8%～86.3%,RSD为2.1%～4.7%;超纯水提取组的平均回收率仅为10.2%～11.1%,RSD为5.0%～6.7%。

实验发现,超纯水提取鸭翅样品,离心后提取液仍偏浑浊,经水浴浓缩的液体含有较多杂质。有研究认为纯水提取不利于蛋白质等沉淀,基质干扰严重[5]。加入乙醇-水溶液提取所得的离心液较澄清,而澄清的提取液有利于液体通过固相萃取柱。酸性橙Ⅱ化学结构中含有磺酸基团,溶于水后主体带有磺酸根离子。在乙醇-水溶液中加入氨水,溶液呈碱性,依靠酸碱结合,可以更有效地从样品中提取出酸性橙Ⅱ,并稳定地存在于提取液中。李晶等研究发现氨水的添加可以较大地提高酸性橙Ⅱ的回收率[14]。相反,含有甲酸的乙醇-水溶液呈酸性,降低了对酸性橙Ⅱ的提取率,并且较乙醇-水溶液的提取率小。

图4 不同溶液提取加标样品中酸性橙Ⅱ的回收率Fig.4 Recoveries of acid orange Ⅱin spiked samples extracted by different solutions

2.4 浓缩条件的选择

浓缩提取液一般采用真空或常压水浴[15-17]。为合理安排实验步骤,将约20 mL的首次提取液先浓缩。实验发现若采用真空常温水浴旋蒸浓缩,含有氨水的浓缩液易产生大量气泡,喷出旋蒸瓶造成损失。若采用常压80 ℃水浴加热浓缩[16-17],待将第二次的提取液并入烧杯时,首次提取液已提前挥干,因此选用70 ℃加热,以减缓提取液的挥发速度。而在挥干约6 mL的洗脱液时,降低水浴温度至60 ℃,可在15～20 min后完成,尽量减少高温对目标物的破坏程度。

2.5 固相萃取柱的比较

样品提取液分别借助A～F固相萃取柱净化和富集后,进行液相色谱分析。由图5可见,有两种品牌的混合型弱阴离子交换固相萃取柱(A、B柱)处理组平均回收率较理想,分别为80.8%～86.3%、83.3%～89.2%,RSD均小于5%,对于酸性橙Ⅱ有良好的富集能力。三种品牌的氨基固相萃取柱(D、E、F柱)处理组平均回收率均低于60%,表明该种类型的填料对酸性橙Ⅱ的富集能力欠缺,造成了目标物的损失。

图5 不同种类固相萃取柱处理加标样品的回收率Fig.5 Recoveries of spiked samples treated by different kinds of solid phase cartridges

实验选用的PWAX柱、WAX柱和NH2柱均具有极性吸附和弱阴离子交换的双重作用,酸性条件下弱阴离子固相萃取填料的活性位点能与酸性橙Ⅱ中的磺酸根发生离子交换[18],从而达到吸附酸性橙Ⅱ和去除杂质的目的；在碱性条件下电性中和,酸性橙Ⅱ被洗脱下来。通过比较发现,Cleanert PWAX柱(A柱)和Oasis WAX柱(B柱)上样时,样液可顺利通过填料流下;同样规格的CNW poly-sery PWAX柱(C柱)在上样时却容易发生堵塞,延缓了实验进度,加标回收率也不及前两种品牌的混合型弱阴离子固相萃取柱高。国家标准SN/T 3536-2013推荐使用氨基阴离子交换固相萃取柱(NH2柱)[4],但在本实验中发现,选用的三种品牌的NH2柱(D、E、F柱)在上样过程中,均需加压才能使样品溶液流出,若提取液浑浊,则易造成堵塞,前处理耗时较Cleanert PWAX柱和Oasis WAX柱长;加标样品经过NH2柱处理,回收率均明显低于Cleanert PWAX柱和Oasis WAX柱。结果表明,使用Cleanert PWAX柱和Oasis WAX柱进行样品的净化和酸性橙Ⅱ的富集,实验效率和加标回收率均优于其他处理。

2.6 样品测定

分别对6种酱卤肉制品和加标样品按1.2.2进行处理,固相萃取柱采用A柱,每个添加水平平行测定6次,经检测,选用的酱卤肉制品中均未检出酸性橙Ⅱ,样品色谱图中目标峰周围无杂质干扰峰,其中鸭翅空白样品和加标样品色谱图如图6所示。加标样品中酸性橙Ⅱ的回收率如表1所示。结果表明,以本地区居民常食用的鸡、鸭、猪为原料的酱卤肉制品的平均加标回收率达到80.7%～89.3%,RSD为2.1%～6.1%,该检验方法的回收率和重现性均较好。

图6 空白样品和加标样品色谱图Fig.6 Chromatogram of blank sample and spiked sample

表1 不同种类酱卤肉制品的加标回收率(n=6)Table 1 Recoveries of different spiked soy sauce and pot-roast meat products(n=6)

3 结论

在本文的液相条件下,酸性橙Ⅱ在0.1～5 μg/mL内线性良好,相关系数(r)为0.99998,检出限(S/N=3)为0.01 mg/kg。通过比较各处理组的平均加标回收率,氨水-乙醇-水溶液(体积比20∶70∶10)能更有效地提取酱卤肉制品中的酸性橙Ⅱ;在样品净化和富集阶段,采用Cleanert PWAX柱或Oasis WAX柱,样品的平均加标回收率均在80%以上,RSD在10%以内,适用于多种酱卤肉制品中酸性橙Ⅱ的检测。其中Oasis WAX柱处理组的平均加标回收率略高于Cleanert PWAX柱处理组。若不考虑价格因素,可选用Oasis WAX柱;若考虑日常大批量实验的成本,选用Cleanert PWAX柱性价比更高。

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