华中枸骨叶抑菌物质提取工艺优化及其抑菌作用研究

2017-10-16,

食品工业科技 2017年18期

(湖北民族学院医学院,湖北恩施 445000)

杜银香,胡泽华*

(湖北民族学院医学院,湖北恩施445000)

本文以抑菌圈直径为指标,以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为指示菌,比较煎煮法、超声提取、回流提取三种方法所得提取物的抑菌效果,确定最佳的提取方法。在此基础上通过单因素和正交实验优化该方法的提取工艺,最终测定优化工艺条件下的提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、宋内志贺菌、白假丝酵母菌的抑菌效果。结果表明:最佳提取方法为超声波法水提,优化的工艺条件:在超声功率250 W,室温下提取,料液比1∶25 (g∶mL),每次30 min,提取2次,此条件下的提取物(原液)对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌圈直径分别为24.67、15.67 mm,对产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、宋内志贺菌的抑菌圈直径为13.67～17.33 mm,对白假丝酵母菌无抑菌作用。

华中枸骨叶,正交实验,抑菌作用

Abstract:The size of inhibition zone was the index,S.aureusandE.coliwere the indicator bacteria,to determine the best extraction method by comparing the bacteriostatic effect of extracts from water extraction,ultrasonic extraction,reflux extraction.Basis on the single-factor experiment,orthogonal experiment was used to optimize the extraction process.The effect of extracts from the optimal process onS.aureus,E.coli,E.aerogenes,P.aeruginosa,S.sonnei,C.albicanswas determined. The results showed that the best extraction process was the use of water as solvent,ultrasound extraction,ultrasonic power 250 W,at room-temperature,material liquid ratio of 1∶25,extraction for 30 minutes,extracted 2 times. Under these condition of extraction,the diameter of bacteriostatic rings againstS.aureus,E.coliwere 24.67 mm and 15.67 mm,and the diameter of bacteriostatic rings againstE.aerogenes,P.aeruginosa,S.sonneiwere 13.67～17.33 mm,and the extraction had no inhibitory effect onC.albicans.

Keywords:leaf ofIlexcentrochinensisS. Y. Hu;orthogonal test;antimicrobial effect

华中枸骨(IlexcentrochinensisS. Y. Hu)为冬青科冬青属植物,别名为针齿冬青,生长在海拔300～1000 m的山坡灌丛中。华中枸骨在湖北恩施地区植物资源丰富,因其具有清热解毒功效,在恩施民间常用其叶来治疗烫火伤[1],并且效果较好。在我国某些地区其叶常被用作苦丁茶的原料[2-4]。现代研究发现,华中枸骨叶中含有黄酮类、三萜类等物质[5-7],这些成分均具有很好的抑菌作用。国内外对冬青科冬青属植物的研究表明,该属植物有抗菌、抗病毒等作用[8-10]。但是,目前对华中枸骨的研究主要集中在医疗保健方面[11-12],尚无其抑菌作用方面的研究报道。

中草药由于提取工艺不同,得到的化学成分不同,药效也各异,不同的中草药都有其最适宜的提取工艺[13-14]。为了更好的提取出华中枸骨叶中有效抑菌物质,本实验以抑菌圈大小为指标,以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为指示菌,通过比较煎煮法、超声提取、回流提取三种方法所得提取物的抑菌效果,确定最佳的提取方式,并在单因素实验的基础上采用正交实验优化提取工艺,同时测定优化工艺条件下的提取物对常见细菌的抑菌效果,旨在为华中枸骨这一土家资源在抑菌方面的研究开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

华中枸骨叶采自湖北省恩施州建始县,经湖北民族学院医学院药用植物与鉴定学教研室鉴定为冬青科冬青属植物华中枸骨(IlexcentrochinensisS.Y.Hu)的叶,自然晒干后,粉碎成粗粉,过40目筛后备用;供试菌种金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠埃希菌(E.coli)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、宋内志贺菌(S.sonnei)、白假丝酵母菌(C.albicans) 由湖北民族学院医学院微生物实验室提供;MH琼脂培养基、沙保氏培养基杭州微生物试剂有限公司;无水乙醇分析纯,天津市福晨化学试剂厂。

NU-425-400S生物安全柜美国NuAire公司;CL-32L高压蒸汽灭菌器日本ALP公司;XMT-9017电热恒温恒湿培养箱重庆永恒实验仪器厂;SSW微电脑电热恒温水槽上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SHZ-D循环水式真空泵巩义市予华仪器设备有限责任公司;CQ-250超声波清洗器上海弘兴超声电子仪器有限公司;RE-3000旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 华中枸骨叶提取物的制备煎煮法[15]:称取华中枸骨叶粗粉10 g,以料液比1∶10 (g∶mL)加入蒸馏水,沸水提取3次,每次煎煮60 min,合并3次的提取液,抽滤,旋转蒸发仪浓缩至剩少许液体时,再在水浴锅上蒸发至剩10 mL液体为止,即得到提取液原液1 g/mL(相对于生药),0.22 μm薄膜滤菌器过滤后备用。

超声提取[16]:称取华中枸骨叶粗粉10 g两份,分别以料液比1∶10 (g∶mL)加入蒸馏水或55%乙醇,在室温、超声功率250 W下,超声提取30 min,提取3次,合并3次的提取液,抽滤,旋转蒸发仪浓缩至剩少许液体时,再在水浴锅上蒸发干,加10 mL蒸馏水溶解,即得到提取原液1 g/mL(相对于生药),0.22 μm薄膜滤菌器过滤后备用。

回流提取[16]:称取华中枸骨叶粗粉10 g,以料液比1∶10 (g∶mL)加入55%乙醇,在75 ℃水浴中加热提取60 min,提取3次,合并3次的提取液,其它操作同超声提取。

1.2.2 抑菌实验采用牛津杯法进行抑菌实验[17]。在直径90 mm MH琼脂平板上(真菌用沙保氏培养基)加入0.1 mL菌液(取对数期的细菌用生理盐水配成细菌含量为107cfu/mL的菌悬液),用无菌L型玻璃棒涂布均匀,在涂菌后的平板上均匀放置牛津杯,每个小杯中加入药液100 μL(其中1个小杯中加入无菌蒸馏水作阴性对照),最后放入37 ℃恒温恒湿培养箱中培养18 h(白假丝酵母菌培养48 h)后观察结果。十字交叉法测量抑菌圈直径[18]。

1.2.3 超声提取的单因素实验以蒸馏水作为提取溶剂,在超声功率250 W,室温下,分别以料液比、提取时间、提取次数为单因素,以抑菌圈直径为指标,以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为指示菌,考察各因素对华中枸骨叶提取物抑菌效果的影响。

料液比的影响:在确定超声提取时间30 min,提取2次的条件下,以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g∶mL)的料液比加入蒸馏水,比较不同料液比对提取物抑菌活性的影响。

超声提取时间的影响:在上述实验确定的适宜料液比条件下,提取2次,分别提取10、20、30、40、50、60 min,比较不同提取时间对提取物抑菌活性的影响。

提取次数的影响:在上述实验确定的适宜料液比、提取时间的条件下,分别提取1～5次,比较不同提取次数对提取物抑菌活性的影响。

1.2.4 正交实验设计根据单因素实验结果,综合考虑料液比、提取时间、提取次数对抑菌效果的影响,按L9(34)正交实验表安排实验,来确定最佳提取工艺参数[19]。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

1.2.5 不同浓度的提取物对常见菌的抑菌作用将在最佳工艺条件得到的提取物稀释至浓度为500、100 mg/mL,比较不同浓度的提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、宋内志贺菌、白假丝酵母菌的抑菌作用。

1.2.6 统计方法数据用SPSS 17.0统计软件进行处理,用均数±标准差表示,多样本均数用方差分析,以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 提取方式选择

表2 不同方式得到的提取物对细菌的抑菌效果(n=6)Table 2 The antibacterial activities of extracts in different ways(n=6)

注:同列数据中标有不同的小写字母表示差异显著(p<0.05)。

由表2可知,以金黄色葡萄球菌为指示菌,以水为溶剂超声法得到的提取物与其他三种提取物的抑菌效果比较差异显著(p<0.05)。以大肠埃希菌为指示菌,以水为溶剂超声法得到的提取物与水煎煮法得到的提取物抑菌效果比较差异显著(p<0.05),但与另外两种提取物抑菌效果比较差异不显著(p>0.05)。因为超声提取法具有提取时间短、提取效率高、操作简便等优点[20],同时所用溶剂为水，比55%乙醇成本低,因此选择以水为溶剂的超声法来提取华中枸骨叶中的抑菌物质。

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对抑菌效果的影响由图1可知,在料液比1∶10～1∶25的范围内,随着料液比增加,抑菌圈越来越大,当料液比为1∶25时,抑菌圈直径达到最大。但随着料液比的继续增加,抑菌圈直径并没有增加。这可能是由于随着料液比的增加,植物细胞内外物质的浓度差越大,越利于抑菌活性物质的溶出;但当料液比过大时,分散了超声波对华中枸骨叶粉末的作用,使得在相同提取条件下胞内抑菌物质的扩散及溶解都减少[21-22]。同时,溶剂用量加大,也会给后续的提取浓缩工作造成困难,提高生产成本。因此,正交实验时料液比选择1∶25左右。

图1 料液比对提取物抑菌效果的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on antibacterial activity of extract

2.2.2 提取时间对抑菌效果的影响由图2可知,在10～30 min时,随着提取时间的增加,抑菌圈直径逐渐增加,可能是随着提取时间延长,越来越多的抑菌活性物质溶解到提取液中。当提取30 min时,其抑菌圈直径最大。但随着超声提取时间的进一步延长,抑菌圈直径却逐渐减少,可能是超声波作用时间过长,使其中有效抑菌成分的结构发生了破坏。因此,正交实验时提取时间选择30 min左右。

图2 提取时间对提取物抑菌效果的影响Fig.2 Effect of extraction time on antibacterial activity of extract

2.2.3 提取次数对抑菌效果的影响提取次数对抑菌效果的影响如图3所示,随着提取次数的增加,抑菌圈直径先增加后减少,提取2次时,抑菌圈直径最大。可能随着提取次数的增加,其他物质也逐渐溶解出来,影响了提取液的抑菌效果。因此,正交实验时提取次数选择2次左右。

图3 提取次数对提取物抑菌效果的影响Fig.3 Effect of extraction time on antibacterial activity of extract

2.3 正交实验结果

由表3、表4的结果可知,各因素对华中枸骨叶提取物的金黄色葡萄球菌抑菌效果影响的大小顺序为提取次数(C)>料液比(A)>提取时间(B),三个因素各水平之间差异均有统计学意义(p<0.05),从极差和方差分析结果得出,从华中枸骨叶中提取对G+金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的条件为A2B2C2。

表4 方差分析结果(金黄色葡萄球菌)Table 4 Result of variance analysis(S. aureus)

表5 方差分析结果(大肠埃希菌)Table 5 Result of variance analysis(E. coli)

表3 正交实验结果(n=3)Table 3 Results of orthogonal test(n=3)

表6 不同浓度的提取物对常见菌的抑菌作用Table 6 Bacteriostatic effect of extracts of different concentrations on common bacteria

注:-表示阴性。

由表3、表5的结果可知,各因素对华中枸骨叶提取物的大肠埃希菌抑菌效果影响的大小顺序为提取时间(B)>料液比(A)>提取次数(C),三个因素各水平之间差异均有统计学意义(p<0.05),从极差和方差分析结果得出,从华中枸骨叶中提取对G-大肠埃希菌抑菌效果最好的条件为A2B2C2。

以G+金黄色葡萄球菌、G-大肠埃希菌为指示菌,以抑菌效果为指标,超声法提取华中枸骨叶中抑菌物质的最佳工艺为A2B2C2,即为料液比1∶25 (g∶mL),提取时间30 min,提取2次,此工艺条件下的提取物抑菌效果最好。

2.4 验证实验

在优化工艺的条件下提取华中枸骨叶中的抑菌物质,按照1.2.2抑菌实验方法测定抑菌活性,测得金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为(24.67±0.94) mm,大肠埃希菌的抑菌圈直径为(15.67±0.94) mm,结果显示,在优化工艺下提取的华中枸骨叶中的成分抑菌效果好,说明该工艺条件可以很好的提取出华中枸骨叶中的有效抑菌成分。

2.5 不同浓度的提取物对常见菌的抑菌作用

由表6可知,最佳工艺下的提取物除对白假丝酵母菌没有抑菌效果外,对其他细菌均有抑菌作用,并且随着提取物浓度的提高,抑菌效果逐渐增强。

3 结论

本实验通过对中草药常用提取方法的比较,发现以水为溶剂,超声提取得到的提取物抑菌效果优于其它提取方法,故而选择以水为溶剂,进行超声提取。通过单因素实验和正交实验优化,得到的最佳提取工艺为在室温下,超声功率250 W,料液比1∶25 (g∶mL),提取2次,每次提取30 min,此工艺条件下的提取物(1 g/mL)对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、产气肠杆菌、宋内志贺菌的抑菌圈直径分别为24.67、15.67、13.67、17.33、14.33 mm,对白假丝酵母菌抑菌作用弱。

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