豆腐柴叶总黄酮不同溶剂级分抗氧化活性分析

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(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳 621010;3.江油市春雨生态农业科技有限公司,四川江油 621700)

豆腐柴叶总黄酮不同溶剂级分抗氧化活性分析

熊双丽1,2,马楠1,廖婷婷1,薛朝云3

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳621010;3.江油市春雨生态农业科技有限公司,四川江油621700)

采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、羟自由基、超氧阴离子、还原力、总抗等体外抗氧化活性模型和抗氧化活性综合评价指数,分析四川江油地区不同溶剂萃取的豆腐柴黄酮级分(乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、水)的抗氧化活性。结果显示,不同浓度乙醇提取总黄酮的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性最高。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、羟基自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率、总抗和还原力皆随乙醇浓度的升高而呈现先增强后减弱的趋势,超氧阴离子自由基清除率却随乙醇浓度增加一直降低。综合评价指数显示不同浓度乙醇抗氧化活性依次为75%醇提物>65%醇提物>55%醇提物>85%醇提物>95%醇提物。乙酸乙酯层萃取物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、总抗、还原力及ABTS阳离子自由基清除率要优于其它各萃取层。正丁醇层萃取物的超氧阴离子自由基清除率要优于其它各萃取层。乙酸乙酯层抗氧化活性最佳。豆腐柴叶总黄酮有较好的抗氧化活性,可作为抗氧化剂或者健康食品原料开发。

豆腐柴,黄酮,分级分离,抗氧化

Abstract:The article mainly evaluated the antioxidant ability of total flavonoids in various extracts(ethyl alcohol,ethyl acetate,normal butyl alcohol,chloroform fraction and water)fromPremnamicrophyllaTurcz leaves in Jiangyou area including DPPH radical,ABTS+· radical,hydroxyl radical,superoxide anion radical scavenging effect,reducing power,ferrous ions chelating activities and total antioxidant capacity(FRAP). The free radical scavenging activity of total flavonoids extracted by different concentrations of ethanol was highest in DPPH. The free radical scavenging activity(DPPH radical,·OH,ABTS+·),total antioxidant capacity(FRAP)and reducing power were dependent on the concentration of alcohol increasing first and then decreasing,while the superoxide anion radical scavenging activity was contrary to the increase of alcohol concentration. The comprehensive evaluation index(APC)of tested samples was decreased in the following order:75% ethanol extract>65% ethanol extract>55% ethanol extract>85% ethanol extract>95% ethanol extract. The DPPH radical scavenging activity,FRAP value and reducing power were higher than those of other solvent extracts. The superoxide anion radical scavenging rate of ethyl acetate extract was stronger than those of other solvent extracts. The antioxidant capacity of ethyl acetate extract was strongest according to the APC results. The flavone from leaves ofPremnamicrophyllaTurcz has strong antioxidant activity and can be used as antioxidant or raw materials of healthy food.

Keywords:PremnamicrophyllaTurcz;flavone;fractionation;antioxidant activity

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆腐柴 四川江油春雨生态农业有限公司;2,2′-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS),2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三嗪(TPTZ)和DPPH SIGMA ALDRICH公司;芦丁对照品 华中海威(北京)基因科技有限公司;抗坏血酸 天津欧博凯化工有限公司;乙酸乙酯、乙醇、正丁醇、三氯甲烷、氢氧化钠、硝酸铝等 均为分析纯。

紫外-可见光分光光度计 日本HITACHI公司;真空冷冻干燥机 美国Thermosavant 公司;旋转蒸发仪 巩义市瑞德仪器设备有限公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 豆腐柴叶黄酮类化合物不同溶剂萃取级分的制备 豆腐柴叶经干燥粉碎过60目筛预处理之后,用不同浓度乙醇(55%、65%、75%、85%、95%)进行萃取(料液比1∶37 g/mL、提取温度81 ℃、提取时间3.4 h[6]),分别分析各提取物抗氧化活性。然后,以最佳乙醇浓度和最佳提取工艺提取豆腐柴叶总黄酮[6],将提取液于45 ℃真空减压浓缩至无醇味后用石油醚萃取除去色素类部分,水相再加入3倍体积乙醇,低温静置过夜,离心(4500 r/min,15 min)后将上清液减压浓缩除去乙醇后依次用氯仿、乙酸乙酯及正丁醇对豆腐柴叶总黄酮进行分级萃取,得到极性不同的各级分(水层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层),分别旋转蒸发除去有机溶剂后真空冷冻干燥后进行抗氧化活性分析。

1.2.2 豆腐柴叶不同溶剂萃取级分的抗氧化活性分析

1.2.2.1 DPPH自由基和·OH清除活性测定 DPPH自由基清除活性测定[6-7]。·OH清除活性测定[7]。

S(%)=[(V0-Vi)/V0]×100

式(1)

1.2.2.3 总抗氧化能力 总抗氧化能力采用FRAP法[9-10],并略作修改。样品的抗氧化活性以达到同样吸光值所需的硫酸亚铁毫摩尔数表示。标准曲线绘制:比色管中依次加入浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mol/L的硫酸亚铁溶液各60 μL,加入6.0 mL FRAP工作液(现配现用,0.3 mol/L pH3.6醋酸盐缓冲溶液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液按照10∶1∶1混合而成,预热至37 ℃),混匀后37 ℃水浴准确反应10 min,593 nm波长处测定吸光值(A),由吸光值(y)和硫酸亚铁浓度(x)做回归直线得y=0.2735x-0.0133,相关系数R2=0.9992。

黄酮类化合物不同溶剂萃取级分的总抗氧化能力测定:取不同浓度不同级分的黄酮样品替代硫酸亚铁溶液，按照上述方法测定吸光值(Ai),根据标准曲线计算样品的FRAP值。计算公式为(2):

FRAP(mmol/L)=(Ai+0.0133)/0.2735

式(2)

1.2.2.4 还原力测定 还原力测定采用铁氰化钾法[11]。

1.2.2.5 ABTS阳离子自由基清除率的测定 黄酮类化合物不同溶剂萃取级分ABTS+·清除率参考文献[10],并略作修改。取7.4 mmol/L ABTS储备液和2.6 mmol/L过硫酸钾储备液各0.2 mL,混合后于黑暗条件下放置14 h。用75%乙醇稀释,并用75%乙醇调零,在734 nm 处调整吸光值为0.700±0.005得ABTS+·工作液。取0.1 mL不同浓度样液与ABTS+·工作液3.9 mL混匀,在25 ℃水浴反应6 min后于734 nm处测定吸光值Ai。以去离子水代替ABTS+·工作液测定吸光值A0。按式(3)计算ABTS+·清除率(S):

S(%)=(1-Ai/A0)×100

式(3)

1.2.2.6 抗氧化活性综合评价 采用抗氧化活性综合指数法(APC)评价黄酮类化合物不同溶剂萃取级分的总体抗氧化活性[12-13]。综合上述6种抗氧化活性评价指标,按式(4)计算APC指数。

表1 不同浓度乙醇提取物的总黄酮抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of total flavonoids extracted with different concentrations of ethanol

表2 不同浓度乙醇提取总黄酮抗氧化活性综合评价及排序Table 2 Comprehensive evaluation and ranking of antioxidant activity of total flavonoids extracted with different concentrations of ethanol

APC=∑(各样品各抗氧化指标能力分值/每种方法测定的最大值×使用的方法总数)×100

式(4)

1.3 数据分析

所有样品均设3个重复,测定结果以平均值±标准差表示。使用Excel 2013和SPSS 13.0软件进行数据处理和方差分析。样品间的差异显著性采用单因素方差分析(One Way ANOVA)Duncan新复极差法分析。p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对总黄酮抗氧化活性的影响

一般情况下,植物中黄酮类化合物存在多种不同极性成分,乙醇浓度对总黄酮的提取率和抗氧化活性影响较大[14]。为探究江油地区豆腐柴黄酮的抗氧化活性和构效关系,首先分析了不同浓度乙醇萃取黄酮的抗氧化活性。

2.2 不同溶剂萃取级分的DPPH自由基和羟基自由基清除能力

DPPH自由基体系根据抗氧化剂提供的电子配对,使其颜色褪去或者消失,从而测定物质的抗氧化活性[15-16]。如图1所示,不同溶剂萃取级分对DPPH自由基的清除率在0～0.5 mg/mL浓度范围内随总黄酮浓度的增加而逐渐增强,乙酸乙酯层和正丁醇层萃取物对DPPH自由基的清除率差异不大,且要远优于氯仿层和水层萃取物,与曹稳根[3]等报道的AB-8大孔吸附树脂分离得到的豆腐柴黄酮活性规律一致。在浓度为0.5 mg/mL时,乙酸乙酯层和正丁醇层的DPPH自由基清除率分别高达92.57%±0.06%和91.82%±0.26%,接近于VC95.78%±0.04%,表现出较强的DPPH清除活性,而且都远远高于氯仿层与水层萃取物。

图1 各萃取级分对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of each extraction fraction against DPPH·

如图2所示,各萃取级分对·OH的清除率在0～0.5 mg/mL浓度范围内随待测物浓度的增大而增高,其中氯仿层和乙酸乙酯层在达到0.1 mg/mL后清除率变得较为稳定,正丁醇层和水层清除率仍缓慢增加。乙酸乙酯层、正丁醇层及水层·OH清除率较低,约50%。氯仿层·OH清除率较其它三个级分高,当浓度为0.1 mg/mL时,其羟基自由基清除率为63.54%±0.23%,甚至高于VC58.58%±0.31%,随着浓度的进一步上升,氯仿层萃取物对·OH得清除率不再有明显变化,开始低于VC,这可能与氯仿层黄酮类化合物的结构有关,有待进一步研究分析。

图2 各萃取级分对羟基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of extraction fraction against ·OH

2.3 不同溶剂萃取级分的超氧阴离子自由基清除能力和总抗氧化能力

图3 各萃取级分对的清除率Fig.3 Scavenging rate of various extraction fraction against

2,4,6-三吡啶基三嗪(tripyridyl-triazine,TPTZ)可与受试物作用,被还原为Fe2+并呈现出蓝色,于593 nm有最大吸收峰,通过吸光值大小转化为Fe2+当量即可比较抗氧化能力[17]。该值反映测试样品还原力,抗氧化能力与FRAP值呈正相关。由图4所示,在0～0.5 mg/mL浓度范围内,VC和各萃取层萃取物FRAP值随浓度的增大而增加,当浓度大于0.35 mg/mL时,各级分总抗氧化能力从大至小分别为乙酸乙酯层、正丁醇层、氯仿层、水层。

图4 各萃取级分的FRAP值Fig.4 The FRAP value of various extraction fraction

2.4 不同溶剂萃取级分的还原力和ABTS阳离子自由基清除能力

铁氰化钾还原体系测定还原力,可表征待测物自身发生氧化的能力,是评价抗氧化活性的重要指标力[11,19],还原能力越强则抗氧化能力也越强。如图5所示,在0～0.25 mg/mL浓度范围内,各萃取层还原力随浓度的增加而增长,总体呈现线性关系。除水层以外,其它各萃取级分的还原力均大于李保同等报道的银杏叶黄酮的还原力[20]。各层萃取还原力规律同DPPH。

图5 各萃取层还原力Fig.5 Reducing power of extraction fraction

表3 不同溶剂萃取级分的抗氧化活性Table 3 Antioxidant activity of flavonoids in various extracts

表4 不同溶剂萃取级分抗氧化活性综合评价及排序Table 4 Comprehensive evaluation and ranking of antioxidant activity of flavonoids in various extracts

ABTS+·是一种亚稳态离子,易溶于乙醇,于734 nm处有吸收峰。根据受试物的干预对其吸光值的影响,可判断天然产物的抗氧化活性[21]。如图6所示,各萃取层在0～1.0 mg/mL浓度范围内清除率随浓度的增加而增大。乙酸乙酯层的清除率最好,其次是正丁醇层,再次是氯仿层,水层最差。其中,乙酸乙酯层、正丁醇层、氯仿层萃取物的ABTS+·清除均显著高于VC。豆腐柴叶总黄酮各萃取层对ABTS+·的清除效果都优于VC,这与其它抗氧化活性评价指标呈现出了明显的相反趋势,其机制有待进一步研究。

图6 各萃取层对ABTS+·的清除率Fig.6 Scavenging rate of extraction fraction against ABTS+·

2.5 不同溶剂萃取级分抗氧化活性的综合评价

3 结论

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AntioxidantactivityofflavonewithdifferentsolventextractsfromPremnamicrophyllaTurczleaves

XIONGShuang-li1,2,MANan1,LIAOTing-ting1,XUEChao-yun3

(1.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China;2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province,Mianyang 621010,China;3.Jiangyou Chunyu Ecological Agricultural Science and Technology Company,Jiangyou 621700,China)

TS255.1

A

1002-0306(2017)18-0019-06

2017-02-23

熊双丽(1977-)，女，博士,教授，研究方向：功能性食品加工与安全， E-mail:372364129@qq.com。

四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心专职科研创新团队建设基金项目(14tdgc04);四川省科技厅项目(2017NFP0179)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.004