圆红冬孢酵母类胡萝卜素合成突变菌株的筛选

张 超 蕾， 张 素 芳， 刘 冰 南， 王 际 辉

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.中国科学院大连化学物理研究所 生物技术部， 辽宁 大连 116023 )

圆红冬孢酵母类胡萝卜素合成突变菌株的筛选

张 超 蕾1,2， 张 素 芳2， 刘 冰 南1， 王 际 辉1

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.中国科学院大连化学物理研究所 生物技术部， 辽宁 大连 116023 )

利用等离子体诱变与亚硝基胍诱变的方法，构建油脂合成缺陷型菌株或类胡萝卜素合成突变菌株。通过乙酰辅酶A流量的分配，验证油脂合成途径是否为乙酰辅酶A节点处优势分支途径。利用等离子体与亚硝基胍进行复合诱变，等离子体诱变的致死率为95%，亚硝基胍诱变的致死率为90%时，筛选得到圆红冬孢酵母颜色突变株XP-1、XO-3、XY-4和XR-2。突变株的油脂含量、脂肪酸的成分和类胡萝卜素的含量测定结果显示，XP-1、XO-3、XY-4等3个菌株的类胡萝卜含量低于出发菌株NP11，类胡萝卜素的代谢途径受到一定破坏，但类胡萝卜素的降低并没有促进油脂合成的增加。XR-2菌株的油脂含量下降，类胡萝卜素含量相应升高，最高达到0.77 μg/g。结果表明，乙酰辅酶A是一个弱刚性节点，油脂合成途径为此节点的优势分支途径，其产物的减少可有效增加类胡萝卜素合成的增加。

圆红冬孢酵母；等离子诱变；亚硝基胍诱变；油脂；类胡萝卜素；弱刚性节点

Abstract: A mutant strain of oil synthesis, defective strain or carotenoid was constructed by mutagenesis of plasma and guanidine. It is determined that the pathway of lipid synthesis is the dominant branching pathway of acetyl coenzyme A node through the distribution of acetyl coenzyme A flux.Compound mutagenesis was carried out using plasma and nitroso guanidine. XP-1, XO-3, XY-4 and XR-2 mutants were screened out through ARTP and NTG mutagenesis with 95% and 90% lethal rate. The ability of producing lipid,composition of fatty acid and content of carotenoid determination results showed that the carotenoid contents of XP-1, XO-3, XY-4 and other three strains were lower than that in strain NP11, the metabolic pathway of carotenoids have been destroyed, but the decreasing of carotenoid could not promote the increasing of lipid synthesis. The carotenoid content increased with the decreasing of lipid content in strain XR-2, which could reached to 0.77 μg/g. The results indicated that acetyle-CoA is a weakly rigid node, and the pathway of lipid synthesis is the dominant branch of the pathway. The reduction of its products can increase the production of carotenoid synthesis.

Keywords:Rhodosporidiumtoruloides; plasma mutation; nitrosoguanidine mutation; lipid; carotenoid; weakly rigid node

0 引 言

在代谢工程中，把弱刚性节点处占主导地位的分支途径称为优势分支途径，其他分支则称为从属分支[1-2]。阻断从属分支途径，优势途径的末端产物含量也常无显著增加[3-4]。反之，如果要增加从属分支途径产物的产率，则必须通过弱化优势分支途径来实现。圆红冬孢酵母中，乙酰辅酶A作为关键代谢节点，是油脂合成与萜类化合物合成的共同前体[5-6]。在限氮的条件下，乙酰辅酶A更多的流向油脂合成的分支途径，只有少部分流向类胡萝卜素合成途径[7-8]。受限于遗传操作，产油酵母中油脂合成途径是否为乙酰辅酶A代谢节点处的优势分支途径，萜类合成途径是否为从属分支途径，一直没有确切定论。

由于类胡萝卜素含量变化会导致菌株颜色差异，本实验综合利用等离子诱变与亚硝基胍两种诱变方法[9-10]，对菌株进行快速诱变，并高通量筛选颜色突变菌株，分析突变菌株的油脂含量、脂肪酸成分和类胡萝卜素含量，以期判断油脂合成途径是否为乙酰辅酶A节点处的优势分支途径。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 体

圆红冬孢酵母单倍体(Rhodosporidiumtoruloides)菌株 NP11，由本实验室分离鉴定并保藏在4 ℃ YEPD斜面。

1.1.2 培养基

YEPD培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉10；pH 6.0。

限氮培养基(g/L)：葡萄糖 50，硫酸铵 0.1，酵母粉 0.75，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 1.5；pH 6.0。补加10 mL痕量元素溶液，每升痕量元素溶液包含：CaCl2·2H2O 4.0 g，FeSO4·7H2O 0.55 g，ZnSO4·7H2O 0.10 g，MnSO4·H2O 0.076 g，18 mol/L H2SO4100 μL。

1.1.3 主要试剂

亚硝基胍(NTG)，Sigma公司；酵母粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 亚硝基胍诱变与等离子体诱变

1.2.1.1 亚硝基胍诱变致死率曲线

取对数期时的圆红冬孢酵母菌液4.5 mL，用无菌水洗涤2次。离心后加入pH 6的磷酸钾缓冲溶液4.5 mL，取5 mg的NTG溶于少量的丙酮溶液中，加入磷酸钾缓冲溶液至1 mL，配制成NTG溶液。取4.5 mL菌体加入0.5 mL的NTG，使NTG的终浓度为500 μg/mL，处理时间分别为15、30、45、60 min，用硫代硫酸钠终止反应，再用无菌水洗涤2遍后，稀释涂于YEPD培养基上进行培养。

1.2.1.2 等离子体诱变致死率曲线

采用无锡思清源生物科技生产的常压室温等离子体进行诱变。诱变过程：用对数期的菌体进行诱变。取10 μL菌悬液均匀涂于10 mm锭子上，进行等离子体诱变。对诱变的仪器进行参数设置。诱变的气体主要为He，距离2 mm，功率115 W，体积流量12 L/min，时间分别为20、30、40、50、60、70、90 s。根据存活的菌体数目计算致死率曲线。

1.2.2 突变株的筛选

将NP11培养至对数期后，先经过亚硝基胍处理，再进行等离子体诱变。将处理后的菌体在YEPD中培养6 h。将菌液适当稀释后涂于YEPD平板上，挑选出不同颜色的表型突变菌株。

1.2.3 细胞生物量测定

取30 mL菌液，6 000g离心收集细胞后用等体积蒸馏水洗涤2次，湿细胞于105 ℃烘至恒重，以g/L表示细胞生物量。

1.2.4 油脂抽提

将发酵14 d的菌液6 000g离心5 min，细胞用蒸馏水洗涤2次，用酸热法提取[11]。按每克湿细胞加10 mL 4 mol/L HCl，于78 ℃水浴处理1.5 h，冷却后，加入10 mL甲醇振荡2 min。甲醇与氯仿按体积比1∶1加入10 mL氯仿，收集氯仿层，再加入10 mL氯仿振荡2 min，6 000g离心5 min，收集氯仿层，合并氯仿液，加入等体积的0.1% NaCl溶液，无水Na2SO4过滤，用已知质量的接收瓶收集氯仿层，再用氯仿冲洗3次，在旋转蒸发仪上蒸去氯仿，于105 ℃烘干2 h，冷却后称重。

1.2.5 残糖量测定

采用山东省科学院生产的SBA-40B生物传感分析仪进行葡萄糖测定，检测范围在0～1.0 g/L。

1.2.6 脂肪酸组成分析

按文献方法[12]对菌油脂肪酸进行甲酯化，准确称取70 mg油脂，加入5% KOH/CH3OH溶液0.5 mL，70 ℃回流50 min。加入BF3的甲醇溶液0.7 mL，继续回流10 min。冷却后加入少量正己烷，再加入适量蒸馏水，使脂肪酸甲酯被萃取进入正己烷层，正己烷层经洗涤后作为气相色谱的进样样品。

用7890F气相色谱仪对脂肪酸成分进行分析，色谱条件：FFAP石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.4 μm)，进样量0.5 μL，进样器温度250 ℃，检测器(FID)温度280 ℃，柱温200 ℃。脂肪酸通过对照标准样品定性，用面积归一法确定相对质量分数[13]。

1.2.7 类胡萝卜素的提取

测量菌体干重。测量细胞内类胡萝卜素含量。取2 mL发酵液，加入3 mol/L盐酸300 μL，沸水浴3 min，冰水浴3 min，8 000 r/min离心5 min，加入300 μL丙酮振荡混匀，取上清液。该过程重复3次，至菌体颜色变白，收集上清。向丙酮溶液中加入500 μL石油醚和200 μL饱和食盐水，振荡混匀浸提。8 000 r/min离心5 min，小心转移上清至2 mL离心管，在450 nm处测定吸光度[14]。采用下面的公式进行计算：

1.3 数据分析

实验数据以(平均值±标准差)表示。

2 结果与讨论

2.1 亚硝基胍诱变与等离子诱变

2.1.1 亚硝基胍诱变致死率曲线

如图2所示，随着时间的延长死亡率逐渐升高，当NTG的诱变时间为60 min时，菌株的死亡率为100%。所以选择45 min作为诱变时间，菌株的死亡率达到93%。

图1 NTG诱变下的致死率曲线Fig.1 The death rate curve of NTG

2.1.2 等离子体诱变致死率曲线

将培养至对数期的菌液进行等离子体诱变，分别诱变20、30、40、50、60、70、90 s。如图3所示，对菌株诱变70 s，菌体的致死率达到95%；对菌株诱变90 s，菌体的致死率达到100%。

图2 ARTP诱变下的致死率曲线Fig.2 The death rate curve of ARTP

2.2 菌株的筛选

按等离子体诱变的致死率95%和亚硝基胍诱变的致死率90%，分别进行单一因素诱变时，均未能筛选到目标菌株。等离子体与亚硝基胍复合诱变得到4株不同颜色的突变菌株，这4株菌株分别命名为XP-1、XR-2、XO-3、XY-4，颜色分别呈粉色、深红色、橙黄色、黄色，结果如图3所示。

图3 NTG与ARTP诱变的变异菌株Fig.3 Mutants of NTG and ARTP

2.3 4株突变菌株油脂质量分数的测定

通过复合诱变所获得的4株不同颜色的菌株，对4株表型变异的菌株与圆红冬孢酵母单倍体发酵14 d后对其油脂和类胡萝卜素含量进行提取测定，得到结果如表1所示。从表1中可以看出，菌体颜色变浅的XP-1、XO-3和XY-4等3株菌的类胡萝卜素质量分数分别为167.94、238.05、62.12 μg/g，都比出发菌株NP11低，但其油脂含量并没有相应提高，质量分数均在50%以上。菌体颜色变深的XR-2菌株的油脂含量显著降低，仅为0.28 g/g，其类胡萝卜素质量分数相应增加，达到0.77 μg/g。说明油脂合成途径产物的减少可显著提高类胡萝卜素合成途径的乙酰辅酶A流量，增加类胡萝卜素合成。结果表明，在限氮的条件下培养时，油脂合成途径为乙酰辅酶A节点处的优势分支途径，从属分支类胡萝卜素合成通路的通量变化对油脂的含量无明显影响。

表1 发酵后的残糖量、生物量、油脂含量和类胡萝卜素含量

Tab.1 Contents of residual sugar, cell biomass, lipid and caroteniod measured after fermentation

菌株残糖量/(g·L-1)生物量/(g·L-1)w(油脂)/(g·g-1)w(类胡萝卜素)/(μg·g-1)XP-12.1±0.39.2±0.50.54±0.1167.94±16.90XR-234.2±1.42.8±0.40.28±0.2770.09±22.73XO-31.3±0.97.2±0.20.51±0.3238.05±39.82XY-41.2±1.18.9±0.30.61±0.162.12±26.92NP111.2±0.48.9±0.80.57±0.1359.09±69.94

如图4所示，限氮96 h时，油脂合成途径为乙酰辅酶A节点的优势分支。限氮培养时，与乙酰辅酶A合成有关的基因乙酰辅酶A合成酶(Acs1)与ATP-柠檬酸裂解酶(Acl1)上调，从而保证充足的乙酰辅酶A前体供应；乙酰辅酶A下游代谢途径中，与油脂合成有关的基因如乙酰辅酶A羧化酶(Acc1)上调，与萜类化合物合成的有关基因Erg10下调，乙酰辅酶A主要流向油脂合成途径[15]。

2.4 4株特殊表型菌株的脂肪酸成分

用气相色谱分别对脂肪酸C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3成分进行分析，因XR-2积累油脂过少，不作分析。其他3株菌的脂肪酸质量分数如表2所示。3株表型变异的菌株与NP11脂肪酸成分差异不大。主要积累C16:0、C18:1，XP-1可以积累C18:3。

图4 乙酰辅酶A相关代谢支点相关蛋白的 表达调节Fig.4 Expression of acetyl-CoA-associated proteins

表2 GC分析3株特殊表型菌株和NP11的脂肪酸成分

Tab.2 Fatty acid compositions of three different phenotype strains and NP11 estimated by GC

菌株w/%C14:0C16:0C16:1C18:0C18:1C18:2C18:3XP-15.427.10.69.942.211.10.8XO-33.433.80.711.440.56.8—XY-45.040.50.89.534.56.3—NP112.131.20.98.439.29.2—注:“—”代表未检测到。

2.5 4株表型变异菌株的SNP测序

单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换、颠换等。XP-1进行基因组重测序，参考R.toruloidesNP11基因组比对，并进行SNP、分析和注释，对所有突变蛋白进行聚类分析，重点关注油脂合成途径和类胡萝卜合成途径上的关键基因，结果如表3所示。结果显示，非同义突变主要发生在反转录酶、转录因子与类胡萝卜素代谢途径的相关的蛋白。但对颜色表型有贡献的是XP-1的CRT1基因发生突变，310位碱基由C突变成T，使得相应的蛋白质序列104位氨基酸由His突变为Tyr (CAC↔TAC)如图5所示。该关键位点突变导致CRT酶活下降，类胡萝卜素合成减少，从基因水平上验证了发酵结果。

表3 XP-1中反转录酶、转录因子与类胡萝卜素的途径Tab.3 Reverse transcriptase, transcription factor and pathway of carotenoid in XP-1

图5 XP-1突变的氨基酸Fig.5 Mutant amino acid of XP-1

3 结 论

经过等离子诱变与亚硝基胍复合诱变筛选出来的色素变异菌株XP-1、XO-3、XY-4都可以积累50%以上的油脂，而类胡萝卜素的含量与NP11相比有所降低。可以看出，类胡萝卜素代谢途径受到阻遏，并没有对油脂的形成产生影响。在圆红冬孢酵母中油脂的合成为优势途径。所以类胡萝卜素的降低不会对油脂的形成构成影响。所筛选出来的XR-2菌株，与NP11相比可以合成较多的类胡萝卜素，类胡萝卜素的质量分数为NP11的1.97倍，仅能合成28%的油脂。该菌株在限氮的条件下不能生成油脂，说明油脂合成相关的代谢途径被中断，使乙酰辅酶A更多地流向萜类化合物的生成途径。也证明了只有减弱优势途径，才能使乙酰辅酶A更多地流向从属分支途径。同时诱变没有对脂肪酸的组成造成影响。本实验为红酵母的类胡萝卜素合成和萜类化合物生物合成代谢途径重构提供了理论支持，也为类似的代谢节点调控研究提供了重要参考价值。

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ScreeningofcarotenoidsmutantsinRhodosporidiumtoruloides

ZHANG Chaolei1,2, ZHANG Sufang2, LIU Bingnan1, WANG Jihui1

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Division of Biotechnology, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Science, Dalian 116023, China )

TS201.3

A

1674-1404(2017)05-0318-05

2016-04-01.

国家自然科学基金项目(31370554)；辽宁省科技计划项目(2014211003)；辽宁省教育厅创新团队项目(LT2014010)；大连市科技计划项目(2014B11NC088).

张超蕾(1989-)，女，硕士研究生；通信作者：王际辉(1970-)，男，教授.

张超蕾,张素芳,刘冰南,王际辉.圆红冬孢酵母类胡萝卜素合成突变菌株的筛选[J].大连工业大学学报,2017,36(5):318-322.

ZHANG Chaolei, ZHANG Sufang,LIU Bingnan, WANG Jihui. Screening of carotenoids mutants inRhodosporidiumtoruloides[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(5): 318-322.