流动注射-抑制化学发光法测定岩白菜素

2017-10-15高苏亚扈本荃

分析科学学报 2017年2期

张韫，高苏亚，扈本荃

(西安医学院药学院，陕西西安 710021)

岩白菜素(Bergenin，BER)属于异香豆素类化合物，因最早从岩白菜属植物中提取而得名，又名岩白菜内酯、岩白菜宁、矮茶素和矮地茶素等[1]。其生理活性显著，具有良好的止咳、祛痰、镇痛、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等作用[2]，临床上广泛用于支气管哮喘、慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的治疗[3]。已报道的岩白菜素测定方法有：紫外-可见分光光度法(UV-Vis)[4]、荧光光谱法(FS)[5]、电致化学发光法(ECL)[6]、电化学分析法(EA)[7]、毛细管电泳法(CE)[8]、高效液相色谱法(HPLC)[9]、薄层色谱法(TLC)[10]和液-质联用法(LC-MS)[11]等。

流动注射-化学发光联用技术具有灵敏度高、分析速度快、仪器装置简单、易于实现自动化等优点，在医药卫生、环境监测、食品分析等领域具有重要实用价值和广阔的应用前景。研究表明，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)对鲁米诺的化学发光信号具有增敏作用，依此构建了鲁米诺-牛血清白蛋白化学发光体系[12]。该体系与传统化学发光体系相比，检测灵敏度更高，并可用于药物分子与模型蛋白相互作用的研究。本文基于岩白菜素对鲁米诺-牛血清白蛋白体系发光信号显著的抑制作用，建立了岩白菜素的流动注射-化学发光分析法，并应用于药物制剂和生物流体中岩白菜素的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

IFIS-C型流动注射-化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司)，主要由蠕动泵、六通阀、聚四氟乙烯管(1.0 mm i.d.)、样品池和光电倍增管组成。UV762紫外-可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

岩白菜素对照品(纯度≥98%，批号：477907，上海士锋生物科技有限公司)，储备液浓度为2.0×10-4g/mL；鲁米诺(纯度≥97%，Sigma-Aldrich)储备液浓度为2.5×10-2mol/L；牛血清白蛋白(纯度≥98%，Sigma-Aldrich)储备液浓度为2.5×10-5mol/L。以上储备液均于4 ℃保存。实验所用溶液由上述储备液逐级稀释配制。其它试剂均为分析纯。实验用水经艾柯KLZ-UV超纯水机(成都唐氏康宁科技发展有限公司)纯化(电阻率18.3 MΩ·cm)。

复方岩白菜素片(滇虹药业集团玉溪生物制药有限公司，批号20141001，规格：125 mg)。

1.2 实验方法

图1 流动注射-化学发光装置示意图Fig.1 Schematic diagram of the FI-CL system

流动注射-化学发光法测定岩白菜素的装置示意图如图1所示。实验装置由四条管路组成：鲁米诺(NaOH)、牛血清白蛋白、载液(超纯水)、样品溶液；蠕动泵流速为2.0 mL/min。基线稳定后由六通阀定量注入的100L鲁米诺与牛血清白蛋白和岩白菜素的混合液再混合后流入流通池，产生的化学发光信号由光电倍增管(HV:700 V)检测再经IFIS-C数据分析系统记录处理。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

分别对9～19 cm混合管长度和0.5～5.0 mL/min溶液流速进行了优化，综合混合效果及发光强度等因素，选定10 cm混合管长度和2.0 mL/min流速作为实验条件。

考察了鲁米诺浓度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L对体系发光强度的影响，如图2所示。当鲁米诺浓度为2.5×10-5mol/L时，发光信号强而稳定，因此选用该浓度为鲁米诺的实验浓度。鲁米诺浓度为2.5×10-5mol/L时，对1.0×10-3～0.1 mol/L NaOH溶液浓度进行了优化，如图3所示。发现NaOH溶液浓度为2.5×10-2mol/L时，鲁米诺化学发光信号最强，因此选用2.5×10-2mol/L NaOH。

牛血清白蛋白对鲁米诺化学发光具有增敏作用。考察了2.5×10-10～2.5×10-7mol/L牛血清白蛋白溶液对体系化学发光强度的影响。随着牛血清白蛋白溶液浓度的增加，化学发光强度增大，当牛血清白蛋白浓度为5.0×10-9mol/L时发光信号最大，选用5.0×10-9mol/L为牛血清白蛋白的最佳浓度。

图2 鲁米诺浓度对化学发光强度的影响Fig.2 Effect of luminol concentration on CL intensity

图3 氢氧化钠浓度对化学发光强度的影响Fig.3 Effect of NaOH concentration on CL intensity

图4 化学发光强度-时间曲线Fig.4 Relative CL intensity-time profile Curve 1：luminol；Curve 2：luminol-BSA-BER；Curve 3：luminol-BSA；Concentration：luminol 2.5×10-5 mol/L，BSA 5.0×10-9 mol/L，BER 3.0×10-10 g/mL.

2.2 化学发光强度-时间关系曲线

在流动注射系统中对鲁米诺-牛血清白蛋白-岩白菜素的发光行为进行了考察，如图4所示。由图4可知，鲁米诺体系(曲线1)最大发光强度(Imax)为110，对应时间(tmax)为4.4 s，且发光信号在15 s内消失；鲁米诺-牛血清白蛋白(曲线3)体系的Imax从110增加至316，相应tmax从4.4 s缩短至4.0 s；3.0×10-10g/mL岩白菜素存在时，Imax从316降至165，tmax保持不变(曲线2)。在溶液的流速为2.0 mL/min条件下，完成一次分析过程(包括进样和冲洗管路)只需30 s，采样频率120/h。

2.3 稳定性实验

在3.0×10-11g/mL 岩白菜素存在下，将100 μL碱性鲁米诺溶液注入流动注射分析系统，通过记录化学发光强度，测试鲁米诺、鲁米诺-牛血清白蛋白和鲁米诺-牛血清白蛋白-岩白菜素体系的稳定性。该实验持续3 d，系统每天运行8 h，每个结果为7次进样测定的平均值。结果显示相对标准偏差(RSD)小于2.5%，表明化学发光体系稳定性良好。

2.4 标准曲线、精密度和检出限

在最佳条件下，化学发光相对强度△I与岩白菜素质量浓度的对数值在3.0～5.0×105pg/mL范围内呈良好的线性关系，线性方程为:△I=22.92lnc+15.15(c：pg/mL)，相关系数r=0.9948，检出限(3σ)为1.0 pg/mL。岩白菜素质量浓度为0.1、0.5和1.0 ng/mL时，平行测定11次，相对标准偏差分别为2.2%、1.8%和1.5%。不同方法测定岩白菜素线性范围和检出限的比较如表1所示。由表1可知，与其它方法相比，本法具有灵敏度高、线性范围宽的优点。

表1 不同方法测定岩白菜素的比较

2.5 化学发光反应机理探讨

采用紫外-可见分光光度法和流动注射-化学发光法探讨鲁米诺-牛血清白蛋白-岩白菜素反应可能的发光机理，紫外-可见吸收光谱如图5所示。由图5(a)可以看出，当鲁米诺存在时，牛血清白蛋白在其最大吸收波长280 nm附近的紫外吸收明显增强，并有一定红移(～4 nm)；在化学发光体系中(图4)，当牛血清白蛋白存在时，鲁米诺的化学发光强度显著增强，tmax由4.4 s 缩短至4.0 s。说明鲁米诺与牛血清白蛋白之间存在相互作用，可能是由于鲁米诺与牛血清白蛋白分子表面亲水性Trp134活性基团[13]结合，加速鲁米诺激发态电子转移速率并增敏其化学发光[12]。由图5(b)可知，加入岩白菜素后，鲁米诺在其最大吸收波长350 nm处吸光度无明显改变，说明鲁米诺与岩白菜素可能没有相互作用。由图5(c)可知，当岩白菜素存在时，牛血清白蛋白的吸收光谱在280 nm附近蓝移(～5 nm)，且混合后溶液吸光度较单组分吸光度之和降低约14%。综上，鲁米诺-牛血清白蛋白体系化学发光的猝灭可能是由于岩白菜素与牛血清白蛋白发生相互作用所致。据文献报道，岩白菜素可能与牛血清白蛋白疏水空腔中位于Trp212附近的活性位点结合形成复合物[5]，导致牛血清白蛋白分子构象发生改变和鲁米诺-牛血清白蛋白体系化学发光的猝灭。

根据牛血清白蛋白与药物分子相互作用的流动注射-化学发光法模型[12]计算得牛血清白蛋白与药物分子的结合常数Kd为5.3×104，结合位点数n为0.72，结果表明牛血清白蛋白与岩白菜素可能生成了1∶1 的复合物，结合常数在104～105数量级。该结果与文献采用经典荧光猝灭法所得结果相符[5]。

图5 不同反应类型的紫外(UV)吸收光谱图Fig.5 UV absorption spectra profile of different reaction types Concenteration：luminol 5.0×10-5 mol/L，BSA 2.0×10-6 mol/L，BER 1.0×10-6 g/mL.