蛋白质组学分析揭示玉米籽粒发育过程中胁迫相关蛋白的表达特性

于涛，李耕，刘鹏，董树亭，张吉旺，赵斌



蛋白质组学分析揭示玉米籽粒发育过程中胁迫相关蛋白的表达特性

于涛，李耕，刘鹏，董树亭，张吉旺，赵斌

（山东农业大学农学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

【目的】从蛋白质组学的层面探讨玉米籽粒发育过程中胁迫相关蛋白的表达特性，分析其功能，揭示籽粒自身防御系统的分子调控机理。【方法】大田条件下，以玉米品种登海661（DH661）为供试材料，67 500株/hm2密度下种植，开花期人工饱和授粉后第3、5、10、15、20、30、40和50 天（DAP）取果穗中部籽粒。TCA-丙酮沉淀法提取籽粒总蛋白，用同位素标记相对定量（iTRAQ）技术进行蛋白质组学分析。通过匹配Uniprot玉米蛋白数据库鉴定籽粒总蛋白，并且用基因本论（GO）注释按照生物过程、分子功能及细胞组件进行功能分类。分析鉴定籽粒发育过程中显著差异表达的胁迫相关蛋白，并且将其分层聚类以展示其在籽粒发育过程中的表达模式。【结果】通过匹配玉米蛋白数据库，籽粒中总计鉴定到4 751个蛋白，这些蛋白涉及多种生物过程与分子功能，其中代谢过程与分子过程是最主要的两个生物过程，而催化活性与绑定功能是最主要的两个分子功能类别，表明这些生物过程与分子功能对籽粒发育具有重要作用。定量分析检测到123个胁迫相关蛋白在玉米籽粒发育过程中显著差异表达，主要参与籽粒蛋白修饰（33个）、活性氧（ROS）体内平衡（31个）、贮藏物质保护（17个）、病虫害响应（8个）及其他胁迫响应过程（34个）。蛋白修饰相关蛋白主要包含一系列的热激蛋白、肽基脯氨酰顺反异构酶及蛋白二硫键异构酶，并且这些蛋白在籽粒不同发育阶段均显著积累，这对稳定籽粒中的蛋白结构具有重要作用。ROS相关蛋白包含不同的抗氧化酶系，并且主要在籽粒发育前、后期显著积累，维护了ROS的体内平衡。贮藏物质保护相关蛋白主要包含多种蛋白酶抑制剂、油脂体蛋白及油脂体固醇蛋白，并且这些蛋白随着籽粒发育不断上调表达，保护了贮藏物质的合成与积累。病虫害响应相关蛋白同样在籽粒发育后期显著积累，增强了籽粒对生物胁迫的抗性。其他胁迫响应相关蛋白主要包括一系列的晚期胚胎丰富蛋白（LEA）、膜联蛋白、脂质转移蛋白、非特异性脂质转移蛋白及脂氧合酶，其中LEA在籽粒发育后期显著积累，膜联蛋白与脂氧合酶主要在发育前期显著表达，而脂质转移蛋白及非特异性脂质转移蛋白在籽粒不同发育阶段均有积累，表明这些蛋白在籽粒不同发育阶段发挥重要作用。【结论】胁迫相关蛋白在籽粒不同发育阶段显著积累，构建了一个协同、多样、稳定的防御调控机制，维护了籽粒正常的发育过程。

玉米；籽粒发育；iTRAQ蛋白质组学；胁迫相关蛋白；蛋白功能

0 引言

【研究意义】玉米作为食物、饲料的重要来源，其籽粒发育好坏直接关系到最终的产量与品质。然而，籽粒发育过程中不可避免地遭受复杂多样的环境胁迫，显著影响籽粒产量与品质的形成。蛋白是生命活动的直接调控者。因此，在蛋白水平上，深入研究玉米籽粒发育过程中胁迫相关蛋白的表达特性，对于解析籽粒自身防御系统的分子调控机理，增强玉米的抗逆能力，提高籽粒产量与品质具有重要意义。同时，对于玉米育种与栽培种植也具有指导价值。【前人研究进展】玉米籽粒发育源于双受精过程，可划分为三个不同的阶段：早期发育阶段（库容建成期）、灌浆期及成熟期[1]。然而，籽粒在不同发育阶段常常受到多重胁迫，尤其在籽粒成熟期，含水量迅速下降，收获时的籽粒含水量一般低于20%[2]。这种低水分条件下，玉米其他营养组织细胞会迅速失活，而籽粒在吸胀后仍能正常萌发，表明籽粒在发育过程中必须获得充足的耐脱水能力[3]。前人对生物胁迫如细菌、真菌感染[4-5]及非生物胁迫包括干旱[6]、高温[7-8]、弱光[9]和淹水[10-11]对籽粒发育的影响及籽粒应对这些胁迫形态、生理生化的响应机制进行了大量研究。然而，对其发育过程中防御系统的分子调控过程鲜见报道。蛋白质组学可以在蛋白水平解析籽粒发育过程中胁迫响应的分子调控机理，其中同位素标记相对定量技术（iTRAQ）能够在复杂样品中大规模鉴定与定量蛋白[12]。以iTRAQ为基础的蛋白质组学分析在小麦[13]、水稻[14]中的研究表明，多种胁迫相关蛋白在籽粒发育过程中显著差异表达，这些协同表达的蛋白参与籽粒防御调控，保证籽粒在不同发育阶段的正常发育。【本研究切入点】前人针对玉米籽粒发育过程中形态、生理生化的胁迫响应进行了大量研究，但涉及籽粒发育防御系统的分子调控过程鲜见报道。籽粒在不同发育阶段胁迫相关蛋白的表达特性尚不清楚。【拟解决的关键问题】本研究利用iTRAQ蛋白质组学方法，旨在鉴定及描述玉米籽粒不同发育阶段胁迫相关蛋白的表达特性。通过分析这些蛋白的表达特性及潜在的生物学功能，以进一步揭示玉米籽粒发育过程中防御调控的分子机理，为培育玉米耐胁迫新品种及栽培种植提供生物学基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

本试验于2015年在黄淮海玉米区域技术创新中心及山东农业大学作物生物学国家重点实验室进行。试验采用玉米品种登海661，播种前精细整地、造墒。6月15日播种，10月5日收获，种植密度67 500株/hm2。小区面积60 m2（6 m×10 m）。田间管理按照大田标准进行，生育期内水分供应充足，病虫草害预防及时。

吐丝期，选择有代表性、生长一致的植株挂牌标记。开花后人工饱和授粉，分别在授粉后第3、5、10、15、20、30、40及50 天（DAP）于标记的植株取3个果穗。将每个果穗中部籽粒剥离，并选取100粒液氮速冻后移至-80℃超低温冰箱内保存。每个取样时期进行3次生物学重复，用于iTRAQ蛋白质组学的分子生物学研究。

1.2 蛋白提取与含量测定

称取1 g籽粒样品于液氮中研磨，样品悬浮于10倍体积含有10%（v/v）TCA的预冷丙酮溶液中，-20℃沉淀2 h。4℃、20 000×离心 30 min，弃上清液，取沉淀。沉淀中再加入10倍体积预冷的丙酮溶液，清洗沉淀（将沉淀捣碎或悬起），-20℃沉淀30 min，4℃、20 000×离心30 min。重复此过程多次直至沉淀基本为白色，后经真空干燥得到粉末状蛋白。称取0.2 g蛋白干粉溶解于3 mL裂解液（8 mol·L-1Urea，30 mmol·L-1HEPES，1mmol·L-1PMSF，2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1DTT），超声5 min助溶，4℃、20 000×离心30 min，取上清液。上清液中加入DTT至终浓度10 mmol·L-1，56℃水浴1 h。取出后，迅速加入IAM至终浓度55 mmol·L-1，暗室静置1 h。混合样品中再次加入4倍体积的预冷丙酮溶液，-20℃沉淀3 h。随后，4℃、20 000×离心30 min，取沉淀。沉淀溶解于400 μL的复溶液（0.5 mol·L-1TEAB，0.1% SDS），超声3 min助溶，4℃、20 000×再次离心30 min，取上清液。采用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.3 蛋白消化与肽段标记

每个籽粒样品取100 μg蛋白体积，用含0.1% SDS的TEAB补齐所有样品体积。每100 μg蛋白样品加入3.3 μg的胰蛋白酶，37 ℃水浴24 h。然后，补加胰蛋白酶1 μg，继续37℃水浴24 h。冻干消化液，然后使用TEAB（水﹕TEAB=1﹕1）每管30 μL重新溶解肽段。按照试剂盒说明，用8标iTRAQ试剂中的113、114、115、116、117、118、119及121分别标记3、5、10、15、20、30、40及50 DAP的籽粒蛋白样品。8个标记的蛋白样品室温静置2 h后混合，真空干燥。试验共进行3次生物学重复标记。

1.4 高效液相色谱

混合后的肽段样品溶于10倍体积的强阳离子缓冲液A（10 mmol·L-1KH2PO4，乙腈25%，pH 3.0）。使用高效液相色谱系统并装配强阳离子交换色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，100Å）进行肽段分馏。缓冲液B（10 mmol·L-1KH2PO4，2 mol·L-1KCl，乙腈25%，pH 3.0）用于流动相，流速设置为1 mL·min-1。设置强阳离子交换液相色谱分级梯度（0%，45 min；0—5%，1 min；5—30%，20 min；30—50%，5 min并维持5 min；50—100%，5 min并维持10 min）。总共收集36份洗脱组分，并且根据色谱峰合并为16份。随后，洗脱组分根据使用说明，经C18反相色谱除盐后冻干，-80℃保存。

1.5 质谱鉴定

质谱分析使用纳升液相系统（Shimadzu，Kyoto，Japan）。混合后的蛋白样品经C18色谱柱（75 μm×2 cm，5 μm，100Å）用含0.1%甲酸的乙腈溶液在45 min内浓度梯度由5%上升到80%分离样品，流速为300 nL·min-1。

质谱分析采用Q-Exactive质谱仪（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）检测肽段信号。检测方式如下：正离子模式；母离子扫描范围350—2 000 m/z；一级质谱分辨率：m/z为200时70 000次；AGC target：1e6；一级最大IT：50 ms；扫描范围数目：1；动态排除：15 s。

多肽和多肽的碎片的质量电荷比，按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱，二级质谱激活类型：HCD；隔离窗：2 m/z；二级质谱分辨率：m/z为200时17 500次；微碎片图谱数：1；二级最大IT值：100 ms；规一化碰撞能量：28 eV；填充率：1%。

1.6 数据分析

对于蛋白鉴定，采用MASCOT软件（版本2.3.01，Matrix Science，London，U.K.）将原始质谱数据自动匹配Uniprot玉米蛋白数据库。搜索参数设置如下：胰蛋白酶作为消化类型，并且允许1个最大的胰蛋白酶漏切位点；固定修饰采用半胱氨酸，可变修饰采用iTRAQ 8-plex（K）、iTRAQ 8-plex（Y）、iTRAQ 8-plex（N-term）及Oxidation（M）；肽段质量误差为15 ppm；串联质谱误差为0.1 Da。蛋白至少含有一个唯一肽段，并且阳性结果错误率（FDR）≤1%才被认为鉴定有效。

对于蛋白定量，由于iTRAQ是相对定量的方法，因此，在每一个生物学重复中均以3 DAP籽粒样品为参考，将后续每个时期的蛋白样品分别与之进行比对。为保证定量结果的准确性，只有蛋白的定量信息至少存在于两次生物学重复中才做进一步分析。以3次生物学重复的平均值作为最终蛋白表达倍率。籽粒发育过程中，平均相对表达水平上调或下调差异大于1.5倍，并且在统计学ANOVA检验上＜0.05的蛋白定义为显著差异表达的蛋白。

鉴定到的玉米籽粒蛋白进行基因本轮（GO）注释，并且按照生物过程、分子功能及细胞组件的功能范畴进行分类[15]。采用Cluster 3.0软件对籽粒发育过程中显著差异表达的胁迫相关蛋白进行表达模式聚类分析，聚类参数使用相似性度量及欧氏距离。聚类结果采用Java TreeView软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 玉米籽粒蛋白鉴定及GO注释

8个时期的籽粒蛋白样品经过提取，用于iTRAQ蛋白质组学分析。通过匹配玉米蛋白数据库，玉米籽粒中总计鉴定到4 751个蛋白，其中2 755个至少存在于两次生物学重复中（图1）。

玉米籽粒蛋白经GO注释，按照生物过程、分子功能及细胞组件的功能范畴进行分类。如图2所示，玉米籽粒中的蛋白涉及多种生物过程与分子功能。生物过程类别中，蛋白广泛参与代谢过程（24.58%）、分子过程（22.85%）、单一生物过程（17.80%）、刺激应答（6.50%）、细胞成分组织（6.30%）、生物过程调控（6.22%）和定位（5.60%）等过程，其中代谢过程（24.58%）与分子过程（22.85%）是其最主要的两个生物过程。分子功能类别中，蛋白主要具备催化活性（43.59%）、绑定（40.90%）、结构分子活性（5.00%）及转运因子（4.10%）等活性，其中催化活性（43.59%）与绑定功能（40.90%）占据最大的两个功能类别。细胞组件类别中，蛋白主要定位于细胞（37.62%）、细胞器（28.49）、细胞膜（14.97%）及大分子复合物中（10.59%）。

图1 3次生物学重复鉴定到的玉米籽粒总蛋白

2.2 胁迫相关蛋白的功能类别与表达特性

如表1所示，GO注释与定量分析发现123个胁迫相关蛋白在籽粒发育过程中显著差异表达。根据这些蛋白的生物学功能，将其划分为以下5种功能类别：蛋白修饰（33个）、ROS体内平衡（31个）、贮藏物质保护（17个）、病虫害响应（8个）及其他胁迫响应过程（34个）。

如图3所示，分层聚类分析将这些胁迫相关蛋白的表达模式划分为5种（A、B、C、D及E）。表达模式A包含23个蛋白，其表达水平在发育前期最高，后随着籽粒发育不断下调；表达模式B包含16个蛋白，这些蛋白在5及40 DAP具有两个表达高峰；表达模式C包含5个蛋白，其表达水平在15—20 DAP显著积累；表达模式D包含34个蛋白，其表达水平在15 DAP开始缓慢上调，并在50 DAP达到最高；表达模式E包含45个蛋白，其表达趋势与D相似，只是在20 DAP开始快速上调表达，并且持续到50 DAP。

2.3 蛋白修饰相关蛋白的表达特性

33个蛋白修饰相关蛋白在籽粒发育过程中显著差异表达，其中包括一系列的热激蛋白，如热激蛋白16.9 kDa I类热激蛋白（编号1）、17.5 kDa II类热激蛋白（编号2）、推测的热激蛋白20伴侣家族蛋白（编号29）、热激蛋白101（编号12）、热激蛋白1（编号13）及3个70 kDa 热激蛋白（编号10、11及32）（表1）。此外，其他参与蛋白修饰的蛋白还主要包括9个肽基脯氨酰顺反异构酶（编号16—24）及3个蛋白二硫键异构酶（编号26—28）（表1）。分层聚类分析显示有6个（A），4个（C）及20个（D和E）蛋白分别在发育的前、中及后期显著积累，而3个（B）在发育的前、后期均显著积累（表2）。

表1 籽粒发育过程中鉴定到的显著差异表达的胁迫相关蛋白

2.4 活性氧（ROS）体内平衡相关蛋白的表达特性

如表1所示，31个显著差异表达的胁迫相关蛋白涉及ROS的体内平衡，主要包括1-Cys过氧化物酶（编号34）、2个抗坏血酸过氧化物酶（编号35及36）、2个多酚氧化酶（编号52及53）、6个谷胱甘肽S-转移酶（编号41—46）、5个超氧化物歧化酶（编号54—58）及6个硫氧还原蛋白（编号59—64）。分层聚类分析显示有8个（A）及16个（D和E）蛋白分别在发育的前、后期显著积累，而仅有1个（C）在发育中期显著表达；此外，有6个（B）蛋白在发育的前、后期均显著积累（表2）。值得注意的是同一蛋白的不同亚型（如谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶及硫氧还原蛋白）具有不同的表达模式，以硫氧还原蛋白为例，6个硫氧还原蛋白亚型中，1个（编号64）亚型在发育中期显著积累，3个亚型在发育后期显著积累，剩下的2个亚型在发育的前、后期均显著积累（表1）。此外，锌金属硫II类蛋白（编号40）在50 DAP的表达水平与3 DAP相比上调高于44倍（表1），显示出其在籽粒发育后期发挥重要作用。

生物过程Biological process：1代谢过程Metabolic process；2分子过程Cellular process；3单一生物过程Single-organism process；4刺激应答Response to stimulus；5细胞成分组织Cellular component organization or biogenesis；6生物过程调控Biological regulation；7定位Localization；8发育过程Developmental process；9多细胞组织过程Multicellular organismal process；10再生Reproduction；11信号Signaling；12多机体过程Multi-organism process；13生长Growth；14免疫系统过程Immune system process；15生物过程调控Biological regulation；16生物附着Rhythmic process；17移动Locomotion；18细胞致死Cell killing。分子功能Molecular function：19催化活性Catalytic activity；20绑定Binding；21结构分子活性Structural molecule activity；22转运因子活性Transporter activity；23分子功能调控Molecular function regulator；24电荷载体活性Electron carrier activity；25抗氧化活性Antioxidant activity；26营养受体活性Nutrient reservoir activity；27分子感应器活性Molecular transducer activity；28核苷酸转录因子活性Nucleic acid binding transcription factor activity；29蛋白质结合转录因子活性Protein binding and transcription factor activity；30金属伴侣活性Metallo chaperone activity。细胞组件Cell component：31细胞Cell；32细胞器Organelle；33细胞膜Membrane；34大分子复合物Macromolecular complex；35膜结合腔体Membrane-enclosed lumen；36细胞间区域Extracellular region；37胞间连丝Cell junction；38共质体Symplast；39超分子纤维Supramolecular fiber；40病毒体Virion；41核状体Nucleoid；42细胞外液Extracellular matrix

表2 分层聚类分析胁迫相关蛋白及蛋白功能在不同表达模式中的分布

2.5 贮藏物质保护相关蛋白的表达特性

17个显著差异表达的胁迫相关蛋白涉及贮藏物质保护，主要包括多种蛋白酶水解抑制剂，如α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂（编号65）、胰蛋白酶抑制剂（编号70）、3个枯草杆菌蛋白酶抑制剂（编号67—69）及7个半胱氨酸蛋白酶抑制剂（编号72—78）（表1）。此外，2个油脂体蛋白（编号79及80）及1个油脂体固醇蛋白（编号81）也被成功鉴定。分层聚类分析显示几乎所有的贮藏物质保护相关蛋白（15个，D及E）的表达均随着籽粒发育不断积累，并且在发育后期达到最高（表2）。

2.6 病虫害响应相关蛋白的表达特性

如表1所示，8个显著差异表达的胁迫相关蛋白涉及病虫害响应，包括抗菌肽MBP-1（编号82）、Bet v I过敏原（编号85）、P21 蛋白（编号86）、主要乳胶蛋白22（编号87）、发病机制相关蛋白1（编号88）、推测的防御素（编号89）及2个几丁质酶（编号83及84）。与贮藏物质保护相关蛋白的表达模式相似，除了Bet v I过敏原蛋白（B）在发育前、后期均显著积累外（表1），剩下的所有病虫害响应相关蛋白（15个，D及E）均在发育后期显著表达（表2）。

2.7 其他胁迫响应相关蛋白的表达特性

如表1所示，34个涉及其他胁迫响应的蛋白在籽粒发育过程中显著差异表达，主要包括一系列的晚期胚胎丰富蛋白（LEA），如2个LEA 1（编号95及96）、3个LEA D-34（编号100—102）及3个LEA 3（编号104—106）。此外，还主要包含2个膜联蛋白（编号90及91）、3个脂质转移蛋白（107—109）、6个非特异性脂质转移蛋白（编号110—115）及4个脂氧合酶（编号120—123）（表1）。分层聚类分析显示8个（A）蛋白在发育前期显著积累，5个（B）蛋白在发育前、中期均显著积累，而绝大多数蛋白（21个，D及E）均随着籽粒发育上调表达，并且在发育后期达到最高（表2）。

3 讨论

3.1 玉米籽粒中的蛋白质组特性

玉米籽粒发育是一个复杂的生理与分子过程。探讨籽粒发育的分子调控机理是解析籽粒发育过程的重要手段。转录组学[16-17]分析表明大量基因在玉米籽粒发育过程中转录表达，涉及籽粒的基础代谢和胁迫响应。相比于转录组学，蛋白质组水平上的研究相对较少，并且过去蛋白质组学研究主要依靠凝胶为基础的试验技术，如双向电泳及荧光双向电泳[18-21]。这些技术存在鉴定通量低、定量不准确等限制因素，如利用双向电泳技术，玉米胚乳[20]及胚胎[21]中仅分别鉴定到504及111个蛋白。较少的蛋白数量必然限制对玉米籽粒整体蛋白质组特性的认识。本研究中，借助iTRAQ技术，玉米籽粒中成功鉴定出4 751个蛋白，其数量显著高于过去以凝胶电泳为基础的蛋白质组学研究[18-21]，充分表明iTRAQ技术的高通量特性。GO注释显示玉米籽粒蛋白涉及多种生物过程与分子功能，其中代谢过程与分子过程是最主要的两个生物过程，而催化活性与绑定功能是最主要的两个分子功能类别（图2）。这些结果与水稻籽粒中的研究相似[14]，表明这些生物过程与分子功能对籽粒发育具有重要作用。值得注意的是一部分蛋白仅仅在单个生物学重复中被检测到（图1），这可能是由个体差异或者每一次独立试验中蛋白肽段提取不一致所导致。

3.2 籽粒发育过程中蛋白修饰相关蛋白的表达特性

籽粒发育过程中的生理代谢受到蛋白的直接调控，而稳定的蛋白结构是其行使功能的首要基础。热激蛋白可作为分子伴侣对新生蛋白进行折叠修饰，特别在胁迫条件下能够稳定蛋白构象、阻止蛋白聚集、对变性及错误修饰的蛋白进行重新折叠修饰[22]。基于热激蛋白的特性，其广泛参与多种分子过程如蛋白代谢、胁迫响应与信号转导[22]。本研究中，8个热激蛋白在籽粒发育过程中显著差异表达且具有不同的表达模式，其中两个70 kDa热激蛋白的亚型（编号10及11）分别在发育前、中期积累，另一个亚型（编号32）与16.9 kDa I类热激蛋白、17.5 kDa II类热激蛋白、热激蛋白101及推测的热激蛋白20伴侣家族蛋白在发育后期显著积累，而热激蛋白1在发育前、后期均显著积累。小麦[13]、水稻[14]籽粒蛋白质组学研究中同样观察到热激蛋白多样的表达模式。这些结果反映出不同类型的热激蛋白可能通过不同的表达模式在籽粒发育过程中行使多重功能。此外，9个肽基脯氨酰顺反异构酶及3个蛋白二硫键异构酶同样显著差异表达（表1）。这两种类型蛋白均参与蛋白的修饰过程，在稳定蛋白结构方面发挥重要作用[23]。值得注意的是除一个肽基脯氨酰顺反异构酶亚型（编号24）在发育前、中期均显著表达外，剩下8个蛋白亚型均在发育后期显著积累（表1），表明肽基脯氨酰顺反异构酶主要在籽粒发育后期发挥重要作用。总之，本研究结果显示蛋白修饰相关蛋白在籽粒不同发育阶段协同表达，这有利于稳定蛋白结构，进而保证蛋白在不同阶段的功能调控。

3.3 籽粒发育过程中的活性氧（ROS）体内平衡调控

ROS平衡体系对维护植物发育过程中生理及分子代谢的正常进行具有重要作用，而ROS平衡被打破会导致植物细胞积累过多的ROS，进而氧化细 胞膜，对细胞结构及重要调控蛋白造成不可逆的损伤[24]。为维持细胞体内的ROS平衡，控制过多ROS带来的毒性影响，植物建立了多重的抗氧化酶系 统[24]。本研究中，31个差异表达的胁迫相关蛋白涉及ROS的体内平衡，包含不同的抗氧化酶系如1-Cys过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、多酚氧化酶、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶及硫氧还原蛋白（表1）。ROS相关蛋白种类的多样性表明多重抗氧化酶系统参与玉米籽粒发育过程的ROS调控。表达分析显示，除1个ROS相关蛋白在中期显著表达外，有8个和16个蛋白分别在发育前、后期显著积累以及有6个蛋白在发育前、后期均显著积累（表2）。分析其原因，一方面在籽粒发育前期，由于籽粒表皮发育还未成熟，外界氧气易通过渗透作用进入籽粒内部而造成籽粒氧含量过高[25]；另一方面在籽粒发育后期，由于水分含量迅速下降易扰乱细胞膜稳定性及破环电子传递链，进而导致ROS的显著积累[26]。因此，玉米籽粒在这两个阶段激活多重的抗氧化酶系统维持了自身ROS的体内平衡。同时，同一蛋白的不同亚型（如谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶及硫氧还原蛋白）具有不同的表达模式（表1），表明在籽粒不同发育阶段不同的蛋白亚型发挥作用。此外，锌金属硫II类蛋白属于金属硫蛋白家族，而该蛋白家族涉及稳定金属离子平衡，解毒、调控ROS平衡等过程[27]。本研究中一个锌金属硫II类蛋白（编号40）在50 DAP的表达水平与3 DAP相比上调高于44倍（表1），显示其在籽粒发育后期发挥重要作用。总之，进一步深入分析这些抗氧化酶的生化反应，将有助于我们理解玉米籽粒发育过程中的ROS调控网络。

3.4 籽粒发育过程中的贮藏物质保护及对生物胁迫的响应

淀粉、蛋白及油脂是玉米籽粒的贮藏物质，其在籽粒灌浆期开始合成与积累，并且在籽粒萌发期间分解，为幼苗生长提供必要的碳、氮资源。本研究中，17个贮藏物质保护相关蛋白被鉴定，包括多种蛋白酶水解抑制剂，如α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、枯草杆菌蛋白酶抑制剂及半胱氨酸蛋白酶抑制剂（表1）。这些蛋白能够防止贮藏蛋白的水解，其中α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂还能防止淀粉的水解退化[28]。除2个推测的半胱氨酸蛋白酶抑制剂（编号77及78）外，剩下的所有蛋白酶水解抑制剂均在籽粒灌浆期开始上调表达，并且在发育后期到达最高（表1），这也与淀粉及贮藏蛋白的积累模式相一致。此外，2个油脂体蛋白及1个油脂体固醇蛋白也在发育后期显著积累（表1）。油脂体蛋白及油脂体固醇蛋白是植物油脂体的主要修饰蛋白，而油脂体是植物储藏油脂的主要场所[29]。在籽粒发育后期，由于水分含量迅速下降，油脂体会相互聚集，显著积累这两种蛋白可能通过调节油脂体大小以及防止油脂体聚集，进而保证油脂的正常积累[29]。总之，这些贮藏物质保护相关蛋白的协同表达保证了贮藏物质正常的合成与积累。

籽粒发育除了受到非生物胁迫，还会受到一些生物胁迫如细菌、真菌感染[4-5]。本研究中，抗菌肽MBP-1、Bet v I过敏原、P21蛋白、主要乳胶蛋白22、发病机制相关蛋白1、推测的防御素及2个几丁质酶被鉴定参与籽粒病虫害响应。其中，几丁质酶能够水解真菌细胞壁，转几丁质酶基因显著提高棉花对枯萎病和黄萎病的抗性[30]。与贮藏物质保护相关蛋白的表达模式相似，除了Bet v I过敏原蛋白在发育前、后期均显著积累外，剩下的所有病虫害响应相关蛋白均在发育后期显著积累（表2）。这些协同表达的蛋白显著增强籽粒对生物胁迫的抗性。

3.5 其他胁迫响应相关蛋白对籽粒发育具有重要作用

本研究中，34个显著差异表达的蛋白涉及其他的胁迫响应，其中包括一系列LEA，并且这些蛋白均在发育后期显著积累（表1），这也与小麦[13]、水稻[14]中的研究结果一致。研究表明水稻中显著积累LEA可提升籽粒后期的耐脱水性[31]。玉米中，这些蛋白还被认为是籽粒保持高活力的必要因子[32]。此外，应对多种生物与非生物胁迫，LEA也会被诱导积累[33]。因此，LEA可以保护籽粒应对多重胁迫，特别是水分迅速下降所带来的干燥胁迫，显著积累这些蛋白提升了玉米籽粒的耐脱水能力。

除了LEA，2个膜联蛋白、3个脂质转移蛋白、6个非特异性脂质转移蛋白及4个脂氧合酶也在籽粒发育过程中显著差异表达（表1）。膜联蛋白与脂氧合酶的活性在胁迫环境下显著增强，表明这两类蛋白在胁迫响应中发挥重要作用[34-35]，其中脂氧合酶还可以通过合成茉莉酸而直接调控胁迫信号的转导[36]。本研究中，2个膜联蛋白及4个脂氧合酶中的3个亚型（编号120—122）均在发育前期显著积累（表1），表明膜联蛋白与脂氧合酶主要在此阶段发挥重要作用。脂质转移蛋白及非特异性脂质转移蛋白能够调控脂类化合物的跨膜运输，广泛参与植物的多重胁迫响应，如低温、干燥、氧化胁迫及微生物感染[37]。本研究中，2个脂质转移蛋白亚型（编号107及109）在发育前期显著表达，5个非特异性脂质转移蛋白亚型（编号110及112—115）在发育后期显著积累，而1个脂质转移蛋白亚型（编号108）及1个非特异性脂质转移蛋白亚型（编号111）在发育前、中期均显著积累（表1）。不同的表达模式反映出脂质转移蛋白及非特异性脂质转移蛋白在籽粒不同发育阶段发挥不同功能。

4 结论

玉米籽粒中鉴定到4 751个蛋白，其中123个胁迫相关蛋白在玉米籽粒发育过程中显著差异表达。这些蛋白主要参与蛋白修饰、活性氧（ROS）体内平衡、贮藏物质保护、病虫害响应及其他胁迫响应过程。这些胁迫相关蛋白在籽粒不同发育阶段显著积累，构建了一个协同、多样、稳定的防御调控机制，维护了籽粒正常的发育过程。

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（责任编辑 杨鑫浩）

Proteomic Analysis of Maize Reveals Expression Characteristics of Stress-Related Proteins During Grain Development

YU Tao, LI Geng, LIU Peng, DONG ShuTing, ZHANG JiWang, ZHAO Bin

(College of Agronomy, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Taian 271018, Shandong)

【Objective】In order to understand the molecular regulation mechanism of defense system in maize grain, the expression characteristics of stress-related proteins during grain development were studied by using approach of plant proteomics.【Method】Denghai 661 (DH661) was used as experimental material and planted at 67 500 plants/hm2in field. The middle grains were harvested after flowering artificial saturation pollination at 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 d, respectively. The total proteins were extracted by the TCA-acetone precipitation method and then were analyzed by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) proteomics. The proteins in maize grain were identified by searching the Uniprot maize protein database and gene ontology (GO) annotation was used to classify the functions of these proteins according to the biological process, molecular function and cellular component. Quantitative analysis was applied to identify stress-related proteins that were significantly differentially expressed during grain development. Hierarchical cluster analysis was used to show the expression patterns of these stress-related proteins during grain development.【Result】A total of 4 751 proteins were identified in maize grain by matching the maize protein database, and these proteins were involved in diverse biological processes and molecular functions, of which the metabolic process and molecular processes were the main biological processes, and the catalytic activity and binding function were the main molecular categories, showing that these biological processes and molecular functions played important roles in maize grain development. Quantitative analysis detected 123 stress-related proteins were significantly differentially expressed during grain development, and these proteins were mainly involved in grain protein modification (33), reactive oxygen species (ROS) homeostasis (31), storage material protection (17), disease response (8) and other stress response process (34). The proteins related to protein modification mainly included a series of heat shock protein, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase and protein disulfide isomerase, and these proteins significantly accumulated at different development stages, which played important roles in stability of protein structure. ROS related proteins contained a variety of antioxidants, and mainly significantly accumulated at both early and late development stages, which maintained the homeostasis of ROS. Storage material protection related proteins mainly contained a variety of protease inhibitors, oleosin and steroleosin, and the expression of these proteins were constantly raised with the grain development, which protected the synthesis and accumulation of storage material. The proteins involved in disease response also significantly accumulated at late development stage, which enhanced the grain resistance to biological stresses. Proteins involved in other stress response mainly included a series of late embryogenesis abundant protein (LEA), annexin, lipid transfer protein, nonspecific lipid transfer protein and lipoxygenase, of which all of the LEA significantly accumulated at late development stage, annexin and lipoxygenase significantly accumulated at early development stage, while lipid transfer protein and nonspecific lipid transfer proteins were accumulated at different development stages, showing that these proteins played important roles in different grain development stages.【Conclusion】Stress-related proteins were accumulated during maize grain different development stages, which constructed a harmonious, diverse and stable defense regulatory mechanism, and thus maintained the normal development of maize grain.

maize; grain development; iTRAQ proteomics; stress-related protein; protein function

2016-09-29；

2017-02-20

国家自然科学基金（31371576，31401339）、国家重点研发计划项目（2016YFD0300106，2016YFD0300205）、国家科技支撑计划项目（2013BAD07B06-2）、国家公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203100，201203096）、山东省现代农业产业技术体系项目（SDAIT-02-08）、国家现代农业产业技术体系建设项目（CARS-02-20）、山东省高等学校科技计划项目（J14LF10）、山东省农业重大应用技术创新课题、山东省玉米育种与栽培技术企业重点实验室

刘鹏，E-mail：liupengsdau@126.com。通信作者董树亭，E-mail：stdong@sdau.edu.cn

联系方式：于涛，E-mail：yutaosdnd@163.com。