炮山甲的HPLC指纹图谱研究Δ

严丹，刘玉杰，胡美变，肖禾，李永川，吴纯洁，3#（.成都中医药大学药学院，成都637；.成都岷江源药业股份有限公司，成都 6000；3.国家中医药管理局中药炮制技术重点研究室，成都 673）

炮山甲的HPLC指纹图谱研究Δ

严丹1＊，刘玉杰1，胡美变1，肖禾2，李永川2，吴纯洁1，3#（1.成都中医药大学药学院，成都611137；2.成都岷江源药业股份有限公司，成都 611000；3.国家中医药管理局中药炮制技术重点研究室，成都 611731）

目的：建立炮山甲的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法：采用HPLC法。色谱柱为Capcell Pak MgⅡS5 C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为0.8 mL/min，检测波长为275 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL。以酪氨酸为参照，测定11批药材的HPLC图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行共有峰指认和相似度评价。结果：11批炮山甲药材的HPLC图谱有23个共有峰，相似度均＞0.90。经验证，11批药材样品HPLC图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。结论：该研究所建HPLC指纹图谱可为炮山甲的鉴别和质量评价提供参考。

炮山甲；高效液相色谱法；指纹图谱；质量评价

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of stir-baked Manis pentadactyla.METHODS：HPLC method was conducted.The determination was performed on Capcell Pak MgⅡS5 C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at the flow rate of 0.8 mL/min.The detection wavelength was set at 275 nm，and column temperature was 30 ℃.The sample size was 10 μL.Using oxyphenylaminopropionic acid as reference，HPLC chromatograms of 11 batches of medicinal materials were determined.TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 A edition）was used for common peak identification and similarity evaluation.RESULTS：There were 23 common peaks in 11 batches of stir-baked M.pentadactyla，with similarity＞0.90.After validation，HPLC chromatograms of 11 batches of medicinal materials were in good agreement with control fingerprints.CONCLUSIONS：Established HPLC fingerprint can provide reference for the identification and quality evaluation of stir-baked M.pentadactyla.

KEYWORDSStir-baked Manis pentadactyla；HPLC；Fingerprint；Quality evaluation

穿山甲为鲮鲤科动物穿山甲Manis pentadactyla Linnaeus的鳞甲，为贵细类中药材，其味咸、性微寒，入肝、胃二经，具有通经下乳、消肿排脓、活血消癥、搜风通络的功效[1]。穿山甲始载于《名医别录》，在历版的《中国药典》中均有收载，可用于经闭癥瘕、痈肿疮毒、乳汁不通、麻木拘挛、关节痹痛等症的治疗。现代药理研究表明，穿山甲具有降低血液黏度，延长凝血时间，升高白细胞等作用[2-5]。临床上，穿山甲一般经炮制后使用，其中炮山甲是穿山甲常用炮制品。然而，2015年版《中国药典》（一部）中收载的炮山甲仅有鉴别、检查项，且“同药材”，严重影响了炮山甲的质量控制，也不能体现炮制的必要性。因此，对炮山甲进行质量评价研究，建立并完善其质量标准对保障炮山甲质量具有重要意义。

中药指纹图谱是建立在中药化学成分系统研究基础上的一种综合的、可量化的鉴定手段，能全面反映中药多组分复杂体系，并能综合反映和有效控制中药的质量，以指纹图谱作为中药质量评价和质量控制已成为国际共识[6-8]。而作为动物药的炮山甲，目前尚未建立有效控制质量的指纹图谱。本课题组采用高效液相色谱法（HPLC）建立炮山甲指纹图谱，以期为完善炮山甲的质量评价和质量标准提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；BP211D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；AS10200AT型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试剂

酪氨酸对照品（成都植标化纯生物技术有限公司，批号：150204，纯度：＞98%）；乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

11批炮山甲药材均由成都岷江源药业有限公司提供（见表1），经成都中医药大学药学院李敏教授鉴定为真品。

表1 炮山甲药材来源Tab 1 Source of stir-baked M.pentadactyla

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Capcell Pak MgⅡS5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，98%B；20～40 min，98%→78%B；40～60 min，78%→72%B；60～65 min，72%→98%B）；流速：0.8 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取酪氨酸对照品5 mg，精密称定，置于5 mL量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取药材样品粉末（过80目筛）约2.0 g，精密称定，置于锥形瓶中，加10倍量水回流提取1 h，滤过，残渣再加5倍量水回流提取1 h，合并滤液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以酪氨酸的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，23个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S1）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以酪氨酸的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，23个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3.0%（n＝6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 精密称取同一批样品（编号：S1）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以酪氨酸的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，23个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的生成及共有峰相关分析

2.4.1 HPLC指纹图谱的生成 取11批药材样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对11批药材样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

图1 11批药材样品HPLC叠加指纹图谱Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 11 batches of samples

图2 药材样品HPLC对照指纹图谱Fig 2 HPLC control fingerprints of samples

2.4.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对11批药材样品的HPLC图谱进行比较分析。结果表明，11批药材样品相似度均＞0.90（见表2）；经验证，11批药材样品HPLC图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。

表2 11批药材样品相似度评价结果Tab 2 Similarity evaluation of 11 batches of samples

2.4.3 共有峰相关数据分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对11批药材样品的HPLC图谱进行比较分析。11批药材样品共有23个共有峰，通过对照品HPLC色谱确定9号峰为酪氨酸。以9号峰为参照峰，计算其他特征峰相对于9号峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表3、表4。

3 讨论

表3 11批药材样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间Tab 3 Relative retention time of common peaks for HPLC chromatograms of 11 batches of samples

表4 11批药材样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积Tab 4 Relative peak areas of common peaks for HPLC chromatograms of 11 batches of samples

3.1 药材样品的代表性

穿山甲已被列为我国二级保护动物，就《关于加强赛加羚羊、穿山甲、稀有蛇类资源保护和规范其产品入药管理的通知》，要求停止野外猎捕活动，核查原料库存并限定使用范围，实行产品标识制度[9]。本课题组所用样品均来自四川省林业厅核查封存库存的生山甲片，由药材公司炮制加工而成，炮制操作过程规范，能保证试验所用药材样品的质量。生山甲片的采集来自全国不同产地，包括广西、云南、贵州和四川等，因此所用药材样品具有代表性。

3.2 提取溶剂和方法的考察

本研究对样品提取溶剂（水、甲醇、乙醇、50%乙醇）进行考察，结果发现以水为提取溶剂时，色谱峰个数较多、且峰面积大，故选择水作为提取溶剂。此外，笔者对超声提取法和加热回流提取法进行了比较，发现加热回流的提取效率高，因此选择加热回流提取法进行样品提取。

3.3 色谱条件的考察

笔者分别考察了甲醇-水-磷酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水3个流动相系统[10-11]，结果表明采用乙腈-水-磷酸为流动相时，各色谱峰的分离度较好、峰形稳定，且基线平稳，因此选用其作为流动相。为了得到质量好的色谱图，笔者对流动相浓度和流速作了进一步试验，发现等度洗脱分离效果不好，易造成峰形堆积，使用梯度洗脱后，可得到较好的色谱。随后，又分别考察了25、30、35℃的柱温对色谱峰的影响，结果表明柱温为30℃时，色谱峰分离度和峰形最好，因此选择30℃柱温进行检测。

3.4 检测波长的选择

以二极管阵列检测器在200～400 nm波长处进行扫描，同时比较了230、254、275、283 nm不同波长下的色谱图信息。结果显示，在275 nm波长处，药材样品色谱峰信息量较多、基线噪音比较低，样品中各成分分离度相对较好。因此，选择275 nm为检测波长进行指纹图谱分析。

综上所述，本课题组首次采用HPLC法建立了炮山甲的指纹图谱。结果表明，不同批次炮山甲样品之间相似度较高，相关性较好，可满足中药指纹图谱相似度评价的基本要求。方法学考察结果表明，本研究建立的HPLC指纹图谱方法稳定、可靠、重复性好，可用于炮山甲的质量评价，有利于保障穿山甲药材的质量。

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Study on HPLC Fingerprint of Stir-baked Manis pentadactyla

YAN Dan1，LIU Yujie1，HU Meibian1，XIAO He2，LI Yongchuan2，WU Chunjie1，3（1.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.Chengdu Minjiangyuan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chengdu 611000，China；3.Key Laboratory of TCM Processing Technology，State Administration of TCM，Chengdu 611731，China）

R283；R917

A

1001-0408（2017）27-3839-04

2016-12-28

2017-02-15）

（编辑：张 静）

国家中医药行业科研专项项目（No.201207004-6）

＊硕士研究生。研究方向：中药炮制与制剂。E-mail：478357452@qq.com

#通信作者：研究员，博士生导师，博士。研究方向：中药炮制与制剂。电话：028-61801001。E-mail：wcj-one@263.net

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.26