复方守宫散的质量标准提高研究Δ

王晓玉，孟 楣，汪永忠（安徽中医药大学第一附属医院药学部/国家中医药管理局中药制剂三级实验室，合肥230031）

复方守宫散的质量标准提高研究Δ

王晓玉＊，孟 楣#，汪永忠（安徽中医药大学第一附属医院药学部/国家中医药管理局中药制剂三级实验室，合肥230031）

目的：提高复方守宫散的质量标准。方法：采用显微鉴别法对制剂中壁虎、梅花进行显微鉴别；采用薄层色谱法（TLC）对制剂中制何首乌进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（简称“二苯乙烯苷”）的含量：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18，流动相为乙腈-水（19∶81，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为320 nm，柱温为25℃，进样量为10 μL。结果：壁虎的皮肤碎片和鳞片、梅花的花粉粒显微特征明显，阴性对照无干扰。制何首乌的TLC图斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰。二苯乙烯苷检测质量浓度线性范围为23～368 μg/mL（r＝0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜1.0%；加样回收率为98.69%～101.61%（RSD＝0.94%，n＝9）。结论：提高的标准能更加有效地控制复方守宫散的质量。

复方守宫散；显微鉴别法；薄层色谱法；含量测定；高效液相色谱法

ABSTRACTOBJECTIVE：To improve the quality standard of Compound shougong powder.METHODS：Gekko japonicas and Armeniaca mume were identified by microscopic identification.TLC method was adopted to identify processed Fallopia multiflora qualitatively.The content of 2，3，5，4-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside（stilbene glycoside）was determined by HPLC.The determination was performed on Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（19∶81，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 320 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：Microscopic characteristics of skin fragments and scales of G.japonicas and the pollen grains of A.mume were significant without interference from negative control.TLC spots of F.multiflora were clear and well-separated without interference from negative control.The linear range of stilbene glucoside were 23-368 μg/mL（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 1.0%.The recoveries ranged 98.69%-101.61%（RSD＝0.94%，n＝9）.CONCLUSIONS：Improved standard can effectively control the quality of Compound shougong powder.

KEYWORDSCompound shougong powder；Microscopy identification method；TLC；Content determination；HPLC

复方守宫散为安徽省中医院肿瘤科特色医院制剂（批准文号：皖药制字Z20080001），由制何首乌、梅花、三七、人参、没药、壁虎6味中药组方而成，具有补虚解毒、消肿止痛之功效，主治肿瘤伴体虚、乏力、纳差、疼痛等，且不良反应小，易为患者接受，在该院应用十余年效果良好[1-5]。该制剂原标准只建立了方中三七、人参的定性鉴别方法，其余药味尚未建立有效的鉴别项目，亦无含量测定项目，故有必要对其质量标准进一步完善和提高，从而保证其临床使用的安全性和稳定性。为此，本研究采用显微鉴别法对制剂中壁虎、梅花进行显微鉴别；采用薄层色谱法（TLC）对制剂中制何首乌进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中制何首乌的主要成分2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（以下简称“二苯乙烯苷”）的含量，从而达到全面控制该制剂质量的目的，以保障临床用药安全、有效。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；HH-S型水浴锅（上海予华仪器公司）；BCD-277型电冰箱（德国Siemens公司）；SK3200H型超声波清洗器（上海科导仪器公司）；D2F-6020型真空干燥箱（天津顺诺仪器公司）；BX43型电子显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 药品与试剂

复方守宫散（安徽省中医院制剂中心自制，批号：20150305、20150507、20150807、20150903、20151129、20151216，规格：50 g/袋）；二苯乙烯苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110844-201310，纯度：100%）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工总厂）；甲醇、磷酸、乙醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

壁虎、梅花药材（安徽省中医院中草药房提供）由安徽中医药大学第一附属医院药学部孟楣主任中药师鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取3批样品（批号：20150507、20150903、20151216）粉末少许，备用。分别按复方守宫散处方和工艺制备缺壁虎、梅花的单一阴性对照品。按2015年版《中国药典》“通则2001”项下的显微鉴别法，采用粉末制片法，分别置于载玻片上，加水合氯醛透化，装片，置于电子显微镜下观察，拍照并保存图像。从样品粉末中主要成分的显微特征方面进行显微鉴别，并对其显微特征加以归纳总结。

2.1.1 壁虎 （1）皮肤碎片。3批样品均可观察到壁虎皮肤碎片，且阴性对照无干扰。壁虎皮肤碎片的具体显微特征概括如下：皮肤碎片较多见，呈浅棕色或黄褐色，团块状，表面观察细胞界限不清楚，密布有棕色或黑色色素颗粒，色素颗粒多聚集呈星芒状，分枝较多[6-7]，详见图1。

图1 壁虎皮肤碎片的显微鉴别图（200×）Fig 1 Microscopic identification of skin fragments of Gekko.japonicas（200×）

（2）鳞片。3批样品均可观察到壁虎鳞片，且阴性对照无干扰。壁虎鳞片的具体显微特征概括如下：鳞片边缘多无色透明，单个鳞片较大，呈卵圆形、多角形、类三角形或类六角形，多呈覆瓦状排列，鳞片中分布有细小的棕褐色至黑色的组织色素颗粒[6-7]，详见图2。

图2 壁虎鳞片的显微鉴别图（400×）Fig 2 Microscopic identification of the scales of G.japonicas（400×）

2.1.2 梅花 3批样品均可观察到梅花花粉粒，且阴性对照无干扰。梅花花粉粒的具体显微特征概括如下：花粉粒类球圆形或钝三角形，直径35～45 μm，表面光滑，具3个萌发孔[8]，详见图3。

图3 梅花花粉粒的显微鉴别图（200×）Fig 3 Microscopic identification of the pollen grains ofA.mume（200×）

2.2 制何首乌的TLC鉴别

取样品5 g，加稀乙醇40 mL，超声（功率：250 W，频率：40 kHz，下同）处理30 min，摇匀，静置，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成二苯乙烯苷质量浓度为20µg/mL的对照品溶液。按复方守宫散处方和工艺制备缺制何首乌的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按TLC法[2015年版《中国药典》（四部）][8]试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液各5µL、阴性对照溶液2µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（7∶3，V/V）为展开剂，展至约3.5 cm，展开，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20∶1，V/V）为展开剂，展开至约7 cm，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，详见图4。

图4 薄层色谱图Fig 4 TLC chromatograms

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（19∶81，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：320 nm；柱温：25 ℃：进样量：10 μL[9]。

2.3.2 对照品溶液的制备 取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成二苯乙烯苷质量浓度为0.23 mg/mL的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取样品约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加稀乙醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，静置，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 阴性对照溶液的制备 按复方守宫散处方和工艺制备缺制何首乌的阴性样品，并按“2.3.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3.5 系统适用性试验 取“2.3.2”“2.3.3”“2.3.4”项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图5。结果，供试品色谱中二苯乙烯苷峰的保留时间与二苯乙烯苷对照品的保留时间一致，且与其他物质峰分离度＞1.5，理论板数按二苯乙烯苷峰计为12 553（将理论板数定为不少于2 000为宜）；阴性对照色谱中，在供试品色谱中二苯乙烯苷峰相应的保留时间处无色谱峰出现，表明阴性对照无干扰。

图5 高效液相色谱图Fig 5 HPLC chromatograms

2.3.6 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液（0.46 mg/mL）0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加稀乙醇定容，制成系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各10 μL，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以二苯乙烯苷质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程y＝23.371x－1.115 9（r＝0.999 9）。结果表明，二苯乙烯苷检测质量浓度线性范围为23～368 μg/mL。

2.3.7 精密度试验 取“2.3.2”项下对照品溶液适量，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，二苯乙烯苷峰面积的RSD＝0.49%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 取“2.3.3”项下供试品溶液（批号：20150507）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10 h时按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，二苯乙烯苷峰面积的RSD＝0.39%（n＝6），表明供试品溶液室温放置10 h内基本稳定。

2.3.9 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：20150507）适量，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，二苯乙烯苷峰面积的RSD＝0.71%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.3.10 加样回收率试验 取已知含量样品（批号：20150507）适量，共6份，分别加入低、中、高质量的二苯乙烯苷对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.11 样品含量测定 取6批样品各适量，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

笔者参考2015年版《中国药典》和相关文献资料，综合考虑用显微鉴别法比较方便、快捷，更适合散剂的质量控制。因此，笔者选择对制剂中的壁虎、梅花、制何首乌、三七、人参等药味分别进行了显微鉴别研究。结果，壁虎的皮肤碎片和鳞片、梅花的花粉粒的显微鉴别特征较为明显，阴性对照无干扰，且方法重复性好，而其他药味显微鉴别均存在不同程度的阴性对照干扰。TLC鉴别中，笔者发现，制剂中制何首乌的薄层色谱斑点清晰，分离度好，且阴性对照无干扰。因此，壁虎和梅花的显微鉴别法、制何首乌的TLC鉴别法均可作为定性鉴别考察指标，建议纳入复方守宫散的质量标准修订草案。

预试验发现，制何首乌中的水溶性成分二苯乙烯苷含量很高，而2015年版《中国药典》（一部）制何首乌的含量测定项下收载了HPLC法测定二苯乙烯苷含量的具体方法[8]。因此，本研究确定以二苯乙烯苷作为制剂的质量控制指标。笔者参考文献[9-11]建立了制剂中二苯乙烯苷的HPLC含量测定方法，经方法学考察证实本方法简便、准确、可靠、重复性好，可有效控制该制剂质量。

综上所述，本研究所建立的标准提高方法能更加有效地控制复方守宫散的质量。

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Study on the Improvement of Quality Standard of Compound Shougong Powder

WANG Xiaoyu，MENG Mei，WANG Yongzhong（Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM/Third Level Lab of TCM Preparation，State Administration of TCM，Hefei 230031，China）

R927

A

1001-0408（2017）27-3832-04

2016-11-28

2017-02-19）

（编辑：张 静）

国家科技支撑计划新安医学传承与发展研究项目（No.2012BAI26B03）

＊主管药师，博士。研究方向：中药新药研发。电话：0551-62838558。E-mail：kane.wang@sohu.com

#通信作者：主任中药师，教授，硕士生导师。研究方向：中药新药研发。电话：0551-62838558。E-mail：ahzyymm@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.24