响应面法优化鬼针草茎中总黄酮的提取工艺

李媛媛，姜艳玲，周洪雷*，张玲，蔡梅超，孙筱林，楚新红

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.济南三株医药生物研究所，山东 济南 250100)

响应面法优化鬼针草茎中总黄酮的提取工艺

李媛媛1，姜艳玲1，周洪雷1*，张玲1，蔡梅超1，孙筱林2，楚新红2

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.济南三株医药生物研究所，山东 济南 250100)

本文以黄酮的提取率为指标，考察乙醇浓度、用量、提取次数、提取时间对提取结果的影响，通过Box-Behnken设计建立响应面模型来优选鬼针草茎中总黄酮的提取工艺参数。结果表明，鬼针草茎中总黄酮最佳提取工艺为乙醇体积分数70%，液料比12∶1(mL/g)，提取次数3次，提取时间1.5 h。在此条件下，总黄酮的提取率可达到0.95%，与理论值0.98%的相对误差为3.06%。

鬼针草；总黄酮；提取；响应面法

Abstract∶In this paper, the flavonoids extraction rate was taken as the index, the effects of ethanol concentration, dosage, extraction times and extraction time on the extraction results were investigated, and through Box-Behnken design, the response surface model was established to optimize the parameters of the technology for extracting total flavonoids from Bidens bipinnata L. stems. The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids fromBidensbipinnataL. stems. were as follows: the ethanol volume fraction was 70%, liquid-solid ratio was12∶1(mL/g), extracted 3 times, and the extraction time was 1.5 h. In these conditions, the maximum extraction rate of total flavonoids could reach 0.95%, and the relative error was 3.06% when compared with the theoretical value of 0.98%.

Key words∶BidensbipinnataL.; total flavonoids; extraction; the response surface methodology

鬼针草(BidensbipinnataL.)为菊科一年生草本植物，民间药用历史悠久，治疗作用广泛，药材资源丰富[1]。鬼针草黄酮类物质一直是研究的热点，大量文献表明[2-6]，黄酮具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗菌抗病毒、免疫调节以及抗炎镇痛等作用。目前对鬼针草的研究大多数是以全草为研究对象，对鬼针草不同药用部位的研究相对较少，研究鬼针草不同药用部位总黄酮的含量，对鬼针草总黄酮的提纯应用具有重要意义，本实验单独考察鬼针草茎中总黄酮的提取工艺。已有报道的鬼针草总黄酮的提取方法主要有超声提取法和回流提取法[7-8]，超声提取由于噪声污染等问题应用受到限制，回流提取是目前工业化生产应用较为广泛的一种提取方法,对鬼针草总黄酮的乙醇回流提取工艺进行研究具有重要的现实意义。本实验选用Box-Behnken设计进行实验[9-10]，研究乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数对鬼针草茎总黄酮得率的影响，在此基础上，利用响应面法对提取工艺进行优化，得到鬼针草茎中总黄酮的最佳提取工艺,为鬼针草茎中总黄酮的进一步开发利用提供技术支持。

1 仪器与材料

1.1仪器

紫外分光光度计(U-2800，日本日立公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；MP10001电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；BS110S电子分析天平(德国塞多利斯公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海树立仪器仪表有限公司)；旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)。

1.2材料

鬼针草采于山东济南，经山东中医药大学李峰教授鉴定为鬼针草(BidensbipinnataL.)；芦丁对照品(批号：MUST-14102301，成都曼斯特生物技术有限公司)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等药品试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1鬼针草茎中总黄酮的提取及测定

2.1.1 标准曲线的建立

精密称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用体积分数70%乙醇超声溶解，冷却后用70%乙醇定容，得到对照品溶液(0.2 mg/mL)。

选用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH显色法，在509 nm处测定吸光度。其基本步骤如下：精密吸取对照品溶液6 mL，置于25 mL容量瓶中，依次加入质量分数5%亚硝酸钠试液1 mL，摇匀后放置6 min；再加入质量分数10%硝酸铝试液1 mL，摇匀后放置6 min；最后加入质量分数4%氢氧化钠试液10 mL，加水至刻度，摇匀后放置15 min，测定吸光度。绘制标准曲线，以吸光度(A)对浓度(C)作回归计算，得回归方程A=10.731C-0.0136 (r=0.999 9)，总黄酮在0.019 738～0.061 68 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.2 方法学考察

2.1.2.1 精密度实验

取芦丁对照品溶液，于509 nm处测定吸光度值，连续测定6次，计算芦丁相对标准偏差为0.281%，表明仪器精密度好。

2.1.2.2 重复性实验

精密量取鬼针草茎2 g，6份，按2.1.1项下方法制备供试品，测定，计算鬼针草茎中总黄酮的平均含量，计算相对标准偏差为0.399%，说明重复性良好。

2.1.2.3 稳定性实验

取芦丁对照品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h内测定，计算相对标准偏差为0.223%，对照品在24 h内基本稳定，符合含量测定要求。

2.1.2.4 回收率实验

精密量取鬼针草茎样品2 g，6份，分别精密加入芦丁对照品溶液5 mL，按2.1.1项下操作，测定平均回收率为98.81%，计算相对标准偏差为0.95%，说明本测定方法的回收率高，符合含量测定的要求。

2.2响应面法优化鬼针草茎中总黄酮的提取工艺

2.2.1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

在液料比12∶1(mL/g)，回流提取3次，提取时间1 h的条件下，考察乙醇体积分数对黄酮得率的影响。

由图1可知，选用80%乙醇作为提取溶剂提取鬼针草茎总黄酮比较合适。

图1 不同乙醇体积分数考察结果Fig.1 The content of flavonoids versus different ethanol volume fractions

2.2.2 提取时间对黄酮得率的影响

在液料比12∶1，乙醇体积分数80%，回流提取3次的条件下，考察提取时间对黄酮得率的影响。

由图2可知，采用不同提取时间提取鬼针草茎中的总黄酮，1.5 h后随着时间的延长黄酮含量基本稳定，综合考虑选择提取时间为1.5 h适宜。

图2 不同提取时间的考察结果Fig.2 The content of flavonoids versus different extraction time

2.2.3 提取次数对黄酮得率的影响

在液料比12∶1，乙醇体积分数80%，提取时间1.5 h的条件下，考察提取次数对黄酮得率的影响。

由图3可知，黄酮含量随着提取次数的增加而增加，提取3次后变化较为平坦，从节约成本和提高得率考虑，提取3次为宜。

图3 不同提取次数的考察结果Fig.3 The content of flavonoids versus different extraction times

2.2.4 液料比对黄酮得率的影响

在乙醇体积分数80%,回流提取3次，提取时间1.5 h的条件下，考察液料比对黄酮得率的影响。

由图4可知，黄酮含量随着乙醇用量的增加而增加，自液料比12∶1提取后，黄酮含量变化较为平坦，综合成本等考虑，选择液料比12∶1提取为宜。

图4 不同液料比的考察结果Fig.4 The content of flavonoids versus different liquid-solid ratio

2.2.5 鬼针草茎总黄酮的响应面分析结果

选择提取时间、提取次数、乙醇体积分数、液料比4个因素作为参考因素，每个因素选取3个水平，见表1。

表1 Box-Behnken 设计的因素与水平表

用Box-Behnken法设计得到的响应面实验，结果见表2。

表2 鬼针草茎黄酮提取的响应面实验结果

续表2

编号液料比乙醇体积分数提取次数提取时间黄酮提取率/%2001100．352100-110．422200000．762301010．462410100．58250-1100．7426100-10．6227100-10．65

从表3可知，各影响因素对总黄酮提取率的影响不是简单的线性关系。其回归方程为：Y=0.78+0.065A-0.15B+0.11C+0.075D-0.027AB-0.065AC+7.500E-003AD-0.055BC-0.070BD+0.093CD-0.11A2-0.18B2-0.16C2+7.917E-003D2。

响应面对于单因素A、B、C、D构成的三维空间图，可以直观地反映各因素之间的相互作用。通过Design-Expert.8.06软件处理得到响应面分析结果见图5～10。

表3 方差分析结果

图5 液料比与乙醇体积分数Fig.5 Liquid-solid ratio and ethanol volume fraction

图6 液料比与提取次数Fig.6 Liquid-solid ratio and extraction times

图7 液料比与提取时间Fig.7 Liquid-solid ratio and extraction time

图8 乙醇体积分数与提取次数Fig.8 Ethanol volume fraction and extraction times

图9 乙醇体积分数与提取时间Fig.9 Ethanol volume fraction and extraction time

图10 提取次数与提取时间Fig.10 Extraction times and extraction time

由响应曲面图可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率基本上增加很少，同时，总黄酮提取率有明显下降的趋势；随着液料比的增加，总黄酮提取率随之增加，但当液料比增大到一定程度后，其增加趋势不明显；随着提取次数的增加，提取率也随之增加，但提取次数增大到一定程度后，其增加趋势亦不明显；提取时间的变化对总黄酮提取率的影响相对于其他因素影响是最小的。由响应面的陡峭程度可以看出，乙醇体积分数和提取次数对结果的影响非常显著，其次是提取时间和液料比。由以上3D模型图可知，在3个因素设定的范围内所呈现出来的响应面不是传统标准视觉的曲面图，从系统给出的最佳提取条件可以得出，因素之间有较强的交互作用是导致此种现象的原因。根据所得到的模型，预测最优工艺条件为：液料比12.36∶1、乙醇体积分数72.81%、提取次数2.67次、提取时间1.5 h，在此条件下黄酮的提取率理论上可达到0.98%。根据实际工作需要，最佳工艺条件调整为液料比12∶1、乙醇体积分数70%、提取3次、每次1.5 h。

此修正条件下重复3次实验进行验证，实际得到的鬼针草茎总黄酮的平均提取率为0.95%，与理论值相比无显著性差异(P>0.05)。因此，采用Box-Behnken 的中心组合实验设计优化得到的鬼针草茎总黄酮的提取工艺条件准确可靠，具有实用价值。

3 结论

[1]王祺,张燕娜,陈飞虎.鬼针草总黄酮的化学成分及药理作用研究进展[J].安微医药,2009,13(9):1011-1013.

[2]傅超美,冷静.中药发酵的概况与关键技术[J].中国药业,2008,17(15):1-2.

[3]王晓宇,陈冠儒,邓子云,等.鬼针草化学成分研究[J].中国中药杂志,2014,39(10):1838-1844.

[4]王慧.黄酮类化合物生物活性的研究进展[J].食品与药品,2010,12(9):347-350.

[5]延玺,刘会青,邹永青,等.黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J]. 有机化学,2008,28(9):1534-1544.

[6]何佳珂,于洋,陈西敬,等.黄酮类化合物的药物代谢研究进展[J].中国中药杂志,2010,35(21):2789-2794.

[7]杜利月,郭留城.鬼针草总黄酮超声提取工艺优选[J].中国药业,2013,22(23):41-42.

[8]邓亚宁,周斌,赵正保.鬼针草总黄酮有效部位提取工艺的优化[J].山西医科大学学报,2007,38(10):926-929.

[9]王永菲,王成国.响应面法的理论与应用[J].中央民族大学学报(自然科学版),2005，14(3):236-240.

[10]吴伟,崔光华.星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用[J].国外医学药学分册,2000 ,27(5):292-298.

Optimization of alcohol extraction techniques of total flavonoids fromBidensbipinnataL. stems using response surface methodology

LI Yuan-yuan1， JIANG Yan-ling1， ZHOU Hong-lei1*，ZHANG Ling1, CAI Mei-chao1， SUN Xiao-lin2, CHU Xin-hong2

(1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2 Medical Institute of Sanzhu Co., Jinan 250100, China)

R284.2

A

1002-4026(2017)05-0021-07

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.05.004

2016-10-07

山东省科技计划 (2013GSF11903)；山东省自然科学基金(ZR2015HM080)；山东省高校中医药抗病毒协同创新项目(XTCX2014C01-03)

李媛媛(1992—)，女，硕士研究生，研究方向为中药及天然药物有效成分的质量控制。E-mail：1173406691@qq.com

*通信作者,周洪雷(1967—)，男，教授，研究方向为中药及天然药物有效成分的质量控制研究。E-mail：zhouhongleitcm@163.com