蛋白酶水解骨素的对比及其优化研究

肖龙泉， 王新惠， 李云成， 邓 婷， 魏祖晨， 刘达玉

(成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)

蛋白酶水解骨素的对比及其优化研究

肖龙泉， 王新惠， 李云成， 邓 婷， 魏祖晨， 刘达玉

(成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)

选取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶分别对骨素进行酶解，对比了几种酶解液的苦味和水解度.结果表明：风味蛋白酶最适合酶解骨蛋白，其水解产物鲜味明显，无明显苦味；木瓜蛋白酶水解骨蛋白效果最差，其水解产物苦味最为明显；中性蛋白酶水解效果介于风味蛋白酶和木瓜蛋白酶之间.风味蛋白酶水解骨蛋白的最佳酶解条件为：温度50 ℃，加酶量6 000 U/g底物蛋白，pH值为7.0，酶解时间2 h，料液比1∶5(g/mL)，在此条件下其水解度可达34.80%.

猪骨素；羊骨素；酶解；风味蛋白酶

0 引 言

通过对畜禽骨提取物进行水解，能够极大地增加原料中游离氨基酸的含量，最大程度表现其呈味功能.目前，骨素酶解成氨基酸和多肽后，经美拉德反应的产物在肉类工业中的应用已成为新的发展趋势[1].但是，蛋白质酶解产物中的疏水性氨基酸和低分子肽往往存在一定的苦涩味[2-3]，且不同蛋白酶水解时切割位点不一样[4]，导致骨素水解产物苦味程度不一，为了控制水解产物的苦味，首先必须选择合适的酶进行水解.对此，本研究对比了3种酶水解骨素的效果，旨在找到能提升骨素水解产物风味的蛋白酶.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1)实验所用材料.骨提取物(猪骨素∶羊骨素=8∶2)，其蛋白含量22.41%，自制.在牛、羊肉香精实际生产中，因牛羊骨特有风味原因，酶解原料应以猪骨素为主(80%左右)，牛羊骨提取物(20%左右)用于呈现牛羊肉风味特征较为适宜.

2)实验所用试剂.木瓜蛋白酶(酶活力500 000 U/g)，北京奥博星生物技术有限公司，中性蛋白酶(酶活力200 000 U/g)，北京鸿润宝顺科技有限公司，风味蛋白酶(内切酶活力30 000 U/g、外切酶活力10 000 U/g)，广西麦柯欣生物科技有限公司；福林—酚试剂(AR)、L-酪氨酸(BR)，成都市科龙化工试剂厂；40%中性甲醛；碳酸钠、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、酪蛋白、甘氨酸均为国产分析纯.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：JA3103N型电子天平、DN203型电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)，KDN-102C型定氮仪(上海纤检仪器有限公司)，721型分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，PHS-2F数字pH计(上海精密科学仪器有限公司)，HZ85-2型磁力搅拌器、DZKW-4型水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，ZFD-A5140型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 蛋白酶的选择.

由于风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶最适pH值接近骨素的自然pH值，因此水解选用风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶较为合适，并根据3种酶的水解度和苦味评定确定最适水解骨蛋白的酶.

在实验中，准确称取5 g浓缩的骨提取物，然后精确称取相应重量的酶，将酶溶解到缓冲液中，待其完全溶解，按相应的料液比与骨提取物混合均匀，置于水浴锅中加热酶解.

1.3.2 指标测定.

相关指标测定的方法为：总氮，参照GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》的凯氏定氮法；粗脂肪，参照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》的索氏抽提法；水分，参照GB 5009.3-2010《食品中水分的测定》的直接干燥法；灰分，参照GB 5009.4-2010《食品中灰分的测定》的方法；蛋白酶活力，参照SBT 10317-1999《蛋白酶活力测定》的方法；氨基氮，参照GB 18186-2000《氨基酸态氮测定》的甲醛滴定法.

1.3.3 水解度计算.

水解度的计算公式[5]为，

式中，DH为蛋白质水解度；N1为酶解前氨基氮含量；N2为酶解后氨基氮含量；N0为酶解前液中总氮含量.

1.3.4 苦味评定.

以1 g苦丁茶溶于1 L水中，煮沸1 h，过滤澄清后定容至1 000 mL，并将其分别稀释至800、700、600、500、400、300、200、100、50 mg/kg，作为苦味评分标准物[6-7].

感官评定小组由5位有经验的业内人士组成，评定者先用蒸馏水漱口，取待评定液2～3 mL置于口中，10 s后吐出，漱口后品尝标准液，如确认两者味道相近，即可将待评定液的苦味值定为该标准液的苦味值，否则需取其他标准液再品尝，直至确定苦味值.最后取5位人士评定的平均值[8].

1.3.5 酶解条件确定.

1)酶解温度确定.初始pH值为7.0，加酶量6 000 U/g底物蛋白，料液比1∶3(g/mL，下同)，3种酶分别于45、50、55、60、65、70 ℃下对骨素进行2 h酶解后，测其水解度并评定苦味值.

2)酶解时间确定.选取风味蛋白酶，酶解条件为：温度50 ℃， 初始pH值为7.0，加酶量6 000 U/g底物蛋白，料液比1∶3，对骨素进行4 h酶解，每隔0.5 h取样，测其水解度并评定苦味值.

3)底物浓度确定.选取风味蛋白酶，酶解条件为：温度50 ℃， 初始pH值为7.0，加酶量6 000 U/g底物蛋白，分别在1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7的料液比下对骨素进行2 h酶解，测其水解度并评定苦味值.

4)加酶量确定.选取风味蛋白酶，酶解条件为：温度50 ℃， 初始pH值为7.0，酶解2 h，分别选择3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 U/g底物蛋白的酶对骨素进行酶解、测其水解度并评定苦味值.

5)酶解最适pH值的确定.其他条件不变，调节水解体系的pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，测定不同pH值条件下的水解度并评定苦味值.

2 结果与分析

2.1 骨素主要成分

经检测，实验所用骨素主要成分及含量如表1所示.

表1 骨素(骨提取物)成分及含量

2.2 酶解温度对水解度和苦味的影响

在酶解时间2 h，pH值为7.0，加酶量为6 000 U/g底物蛋白，料液比1∶3，分别于40、45、50、55、60、65 ℃下对猪骨蛋白进行酶解，考察酶解温度对水解度、水解液苦味的影响，结果见图1.

图1酶解温度对水解度和苦味的影响

结果表明，木瓜蛋白酶水解效果最差，其次是中性蛋白酶，风味蛋白酶水解效果最好.在风味蛋白酶水解整个过程中，其水解液苦味值变化不明显，始终维持在较低水平，这是因为风味蛋白酶中同时含有内切酶和外切酶，内切酶水解的多肽等产物继续被外切酶水解成氨基酸[9]，使得底物随着水解度增加同时保持苦味值基本不变.此外，3种酶水解后的水解液带有不同程度的鲜味，其中，风味蛋白酶水解后的鲜味更为突出，木瓜蛋白酶水解后先出现一定的鲜味，随后则出现较明显的苦涩味.综合考虑，3种酶中风味蛋白酶最适合水解骨蛋白，且其水解温度相对较低，用于工业化生产时耗能较小，鲜味较为突出，苦味值也较小，利于后续产品的开发应用，故本研究在此后实验中选择风味蛋白酶对骨蛋白进行酶解.

2.3 酶解时间对水解度和苦味的影响

酶解时间对水解度和苦味的影响如图2所示.

结果表明，随着酶解时间的增加，水解度和苦味值增加，在酶解时间1.5～2 h阶段，水解度增加最快， 酶解2 h其水解度可达25.52%. 当酶解时间超过2 h后，水解度增加变缓，而苦味增加不明显.酶解5 h，其水解度仅增加到28.61%.这是因为反应2 h后，底物(蛋白质)大多被消耗，降低了酶促反应速率，从而使得水解度增加缓慢.另外，由于风味蛋白酶中同时含有内切酶和外切酶，内切酶水解的多肽等产物继续被外切酶水解成氨基酸，使得底物随着水解度增加同时保持苦味值变化不明显.

图2酶解时间对水解度和苦味的影响

2.4 底物浓度对水解度和苦味的影响

底物浓度对水解度和苦味的影响如图3所示.

图3底物浓度对水解度和苦味的影响

结果表明，料液比在1∶1～1∶3范围内，随着料液比增加，苦味增加不明显，当料液比增加到1∶4时，苦味增加明显且达到最大值.这是由于随着水解度增加，酶的作用切开了疏水性多肽和疏水性氨基酸，致使苦味变化较大.随着水解度进一步增加，苦味值逐渐变小，这是由于风味蛋白酶中外切酶的继续作用，将疏水性多肽进一步酶解成氨基酸，从而使得苦味降低.实验发现，如需要得到较高水解度的水解液，选取料液比为1∶5较为合适，但考虑到实际生产中后续美拉德反应前浓缩酶解液的耗能情况，综合考量，选取料液比为1∶3.

2.5 加酶量对水解度和苦味的影响

加酶量对水解度和苦味的影响如图4所示.

图4加酶量对水解度和苦味的影响

结果表明，加酶量在3 000～9 000 U/g范围内，随着加酶量的增加，水解度逐渐增加，苦味值先增加后降低.加酶量在3 000～7 000 U/g阶段，底物浓度一定，增加的酶量未使底物浓度饱和，随着酶浓度增加，反应速度加快，蛋白水解度增加明显；当料加酶量过7 000 U/g时，水解度增和苦味增加趋于平缓，由于加酶量过大，过量的酶抑制了反应进行，同时可能导致酶自身溶解，使得酶活力下降，从而减缓了反应速度.考虑到实际生产中酶的成本，综合考量，选取加酶量为6 000 U/g.

2.6 pH值对水解度和苦味的影响

pH值对水解度和苦味的影响如图5所示.

图5 pH值对水解度和苦味的影响

结果表明，pH值在4.0～7.0范围内，随着加酶量的增加，水解度和苦味值逐渐增加；当pH值达到7.0时，水解度和苦味最高；当pH值大于7.0时，水解度和苦味均呈现下降趋势.产生这一现象的原因是酶活力受外界pH值影响，pH值在一定范围内，随着pH值变化，酶分子上的氨基酸侧链基团可处于不同的解离状态，而具有催化活性的离子基团仅是其中一种特定的解离形式.因而pH值在某个点上，具有催化活性的离子基团最多，酶活力最大，该点pH值为酶的最适pH值.最适pH值会由于实验原料和底物浓度的不同会稍有变化，当pH值小于5.0或大于8.0时，酶活力急剧下降，导致水解度下降.

3 结 论

骨提取物的酶解是酶将蛋白质切割成肽类和氨基酸的一个过程，因不同酶水解时切割位点不一样，其水解蛋白效果不一样，同种酶在不同条件下水解效果差异也很大.实验结果表明：在选取的3种蛋白酶中，风味蛋白酶最适合酶解骨蛋白，其水解温度相对较低，水解产物鲜味明显，基本无明显苦味；木瓜蛋白酶水解骨蛋白效果在3种酶中最差，其水解产物苦味最为明显；中性蛋白酶水解效果介于风味蛋白酶和木瓜蛋白酶之间.

本研究认为，风味蛋白酶水解骨蛋白的最佳酶解条件为：温度50 ℃，加酶量6 000 U/g底物蛋白，pH值为7.0，酶解时间2 h，料液比1∶5(g/mL)，在此条件下其水解度可达34.80%.同时，在酶解温度50 ℃，pH值为7.00，风味蛋白酶加酶量6 000 U/g底物蛋白(以外切酶活力计)，料液比1∶3条件下，酶解时间超过2 h后，其水解度趋于平缓.

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Abstract：Papain,neutral protease and flavourzyme are selected in the enzymatic hydrolysis of ossein,respectively.The degree of hydrolysis and bitterness value of different enzymatic hydrolysate are compared.The results show that the most suitable protease to hydrolyze ossein is flavourzyme whose hydrolysate has great fresh flavor and little bitterness.On the other hand,papain is the least suitable protease to hydrolyze ossein,with the most obvious bitterness.The hydrolysis efficacy of neutral protease is between those of the two protease mentioned above.The best enzymatic hydrolysis conditions of flavourzyme are:pH 7.0,hydrolysis time of 2 h,1∶5 solid-liquid rations,enzyme dosage 6 000 U/g,and the degree of hydrolysis could reach 34.80%.

Keywords：pig ossein;sheep pssein;enzymatic hydrolysis;flavor protease enzyme

ComparisonandOptimizationofEnzymaticHydrolysisofOsseinwithDifferentProtease

XIAOLongquan，WANGXinhui，LIYuncheng，DENGTing，WEIZucheng，LIUDayu

(School of Pharmacy and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China)

TS251.94

A

1004-5422(2017)03-0243-04

2017-07-18.

肖龙泉(1988 — )， 男， 硕士， 从事食品生物相关技术研究.