番茄叶绿素a/b结合蛋白基因cab—1a的克隆与定位

朱彬彬　崔百明　向本春

摘要：在进行酵母双杂交试验时发现，马铃薯Y病毒HC-Pro蛋白与番茄未知蛋白发生相互作用，经测序、Blast比对，确认其为番茄叶绿素a/b结合蛋白Cab-1A，Genebank序列号为XM_010318610.1。为初步验证这一发现，设计引物，然后以番茄cDNA文库为模板，克隆出798 bp的cab-1a全长序列，并构建了cab-1a基因的亚细胞定位载体pSPGFP-Cab-1A，并运用叶盘法将其转化到烟草表皮细胞中，在荧光共聚焦显微镜下观察其定位情况。结果表明，cab-1a基因编码的Cab-1A-like蛋白位于细胞核和细胞质中，为与马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）蛋白HC-Pro（helper component proteinase）相互作用的后续研究奠定理论基础。

关键词：番茄；叶绿素a/b；蛋白Cab-1A；亚细胞定位；GFP；烟草表皮细胞

中图分类号： S641.201文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0020-04

光合作用是地球上生命现象的基础，高等植物光合作用光能的捕获与传递主要是通过光捕获叶绿素a/b结合蛋白（chlorophyll a/b binding protein，Cab）来完成[1]，在高等植物中大部分叶绿素分子都结合在光系统Ⅰ（PSⅠ）和光系统Ⅱ（PSⅡ）的天然色素蛋白复合物上[2]。这些蛋白复合物共同组成一个很重要而又很庞大的家族，但特点又不是很明显。光捕获叶绿素a/b结合蛋白Cab是一类能捕获光能，并把光能转化成电能迅速传至光反应中心引起光化学反应的色素蛋白，这些蛋白复合体由属于同一家族的色素结合蛋白与色素结合而形成，然后通过色素结合蛋白的跨膜区将其锚定在类囊体膜上。高等植物中大部分的叶绿素分子都结合在PSⅠ、PSⅡ的捕光色素蛋白复合物上，其中PSⅡ捕光色素蛋白复合物结合的叶绿素约占类囊体膜上色素量的50%[3]，除与光能的传递相关之外，其在响应外界生物胁迫方面也发挥着重要作用[4-5]，且随着电子晶体学研究方法的发展，对Cab蛋白晶体结构的分析也日趋深入[6]。

叶绿素a/b结合蛋白由定位于细胞核内的cab基因编码[7]，核基因cab转录产生的mRNA在细胞质的80 S核糖体上翻译合成前体多肽，这些前体多肽被运进叶绿体并被加工切割成成熟蛋白，其转移过程借助于被称为过渡肽（transit peptide）或引导肽（leader peptide）的N末端扩展序列。过渡肽和切割位点下游6—15氨基酸残基区域是Cab蛋白前体的多变区[8]。

番茄中，目前为止已报道的Cab蛋白有21种[9]，其中Cab-1A为高等植物中的主要光捕获蛋白之一，别称 LHCb1-1。本研究对光捕获叶绿素a/b结合蛋白Cab-1A进行定位，结合对与PVY HC-Pro相互作用的研究，以期为探索叶绿素a/b结合蛋白的新功能奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料

大肠杆菌（Escherchia coil）DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefacieas）GV3101以及各个载体骨架均由笔者所在实验室保存提供。

限制性内切酶XbaⅠ、ClaⅠ、SalⅠ、KpnⅠ、SmaⅠ均购自于赛默飞世尔科技（中国）有限公司。EcoR Ⅰ、T4 DNA ligase、pGEM-T Esay Vector、Wizard DNA clean-up凝胶回收试剂盒等购自普洛麦格生物技术有限公司。DNA MarkerⅢ、Marker DL15000+2000均购自于天根生化科技（北京）有限公司。

从加工番茄（Solanum lycopersicum）里格尔87-5中提取的cDNA、试验所用本氏烟草种子均由笔者所在实验室保存。

1.2方法

1.2.1加工番茄cab-1a基因克隆

以加工番茄里格尔 87-5 cDNA为模板，根据已报道的序列[10]，设计相应的引物（表1），PCR克隆得到cab-1a基因片段。将PCR扩增获得的目的基因片段进行凝胶电泳检测，并对检测到的目的基因片段运用试剂盒进行凝胶回收，进而连接到T载体 pGEM-Easy Vector上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.2Cab-1A-like蛋白的生物信息学分析

运用 ExPASy 程序（http：//www.expasy.org）进行氨基酸序列生物信息学分析[11]；假定蛋白质的多重比对和进化树分析在Vector NTI 11.5进行；跨膜区域和构向预测在TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html）中进行；通过HNN二级结构预测程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html）推定蛋白质的二级结构；三级结构模型建立使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）程序。

1.2.3亚细胞定位载体的构建

设计引物GFP-S/GFP-AS（表1），从pCBGFP：35S-GAi载体上克隆得到绿色荧光蛋白基因GFP序列，经XmaⅠ/SacⅠ双酶切后，凝胶电泳检测并回收目的片段GFP，然后将酶切后的GFP片段连接到同样酶切的双元载体pSPYCE：35S上，转化大肠杆菌并提质粒，酶切鉴定正确后，将构建好的N端定位载体骨架pSPGFP：35S送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。然后将目的基因cab-1a从T载体上酶切下來，连接到N端定位载体上，构建最终定位载体pSPGFP-Cab-1A（图1），并以pSPGFP载体骨架作为对照，酶切鉴定并测序。endprint

1.2.4农杆菌介导的烟草叶片遗传转化

将测序正确的目标载体运用电击法转化至农杆菌GV3101中，克隆PCR，挑取阳性克隆，接种到10 mL的LB液体培养基中（含有相应的抗生素），28 ℃孵育24 h以上，之后在28 ℃、190 r/min摇床振荡至培养基D600 nm为0.6～1.0。将培养液以3 000 g、4 ℃ 离心15 min，收集农杆菌GV3101沉淀。弃废液，向沉淀颗粒中加入新鲜的渗透液[12]（MgCl2 10 mmol/L，MES/KOH 10 mmol/L，pH值5.7，乙酰丁香酮150 μmol/L），使最终悬浮液D600 nm为0.5左右。将含有农杆菌细胞的渗透液在摇床中黑暗孵育2 h，然后用于渗透。

取3周大烟草（本氏烟）植株的顶3叶，采用叶盘法进行组织培养。从组织培养后的叶组织上切取1～2 cm2 的小块置于渗透液中，并于100 r/min摇床上振荡渗透10 min。用灭菌的滤纸吸干表面菌液，置于MS预培养基上，暗处室温下培养 2 d。2 d后置于共培养MS培养基（含相应抗生素）上进行筛选培养，2周更换1次培养基，直至长出2 cm小芽，然后转入MS生根培养基，室温下进行生根，生根2周后进行荧光检测。

取转化后的植株叶片置于载玻片上，滴几滴清水，盖上盖玻片，在共聚焦荧光扫描显微镜下进行观察。

2.1序列比对

番茄cab-1a目的基因的假定蛋白Cab-1A-like序列分别与NCBI公布的cab1a、cab1b、cab1c、cab3a、cab3c、cab6a基因的蛋白序列进行比对分析，相似度达到95%以上（图2），表明克隆的目的基因就是cab-1a，属于Cab家族成员。Cab-1C进化树分析结果（图3）表明，番茄Cab-1A-like蛋白与Cab-1C的亲缘关系更近，而与NCBI上预测的Cab-1A蛋白不属于同一分支，这可能与此蛋白是由假定推测得到的相关，而且与Cab-3C的相似度最低。

2.2生物信息学预测分析

从加工番茄cDNA中扩增出约700 bp的目的条带，测序分析结果表明，cab-1a基因ORF长798 bp，预测可以编码1个含有265个氨基酸的多肽序列。用NCBI CDS对该多肽进行分析，结果表明，加工番茄Cab-1A-like蛋白具有叶绿素a/b结合蛋白家族结构域，属于该家族成员（图4）。

用iPSORT（http：//ipsort.hgc.jp/）序列分析表明，番茄的Cab-1A-like蛋白N端有1个潜在的叶绿体转运肽（MAAATMALSSPSFAGQAVKLSPSASEISGN）。

此外，ExPASy（http：//web.expasy.org/peptide_mass/）对其预测结果表明，Cab-1A-like蛋白分子量约是 28.07 ku，等电点（PI）为5.51，保守序列约占92.1%。对Cab-1A二级结构的预测结果表明，其有3个跨膜螺旋，且有35.09% α-螺旋、8.68% β-折叠、56.2%的无规卷曲结构。

三级结构模型用Swiss Model（http：//swissmodel.expasy.org/templates/1rwt.1）进行预测，其空间结构与菠菜（SMTL id：1rwt.1）的Cab蛋白有95.65%相似度。

2.3亚细胞定位载体的鉴定

取菌落PCR阳性克隆，提取质粒DNA，并根据所设计引物进行XbaⅠ/KpnⅠ双酶切鉴定，获得1条约800 bp的条带，该条带为目的基因cab-1a（图5），与预期相符，对酶切正确的质粒进行测序，结果表明，构建的亚细胞定位载体是正确的。

2.4荧光检测

将双元表达载体pSPGFP-Cab-1A运用电击法转化到农杆菌GV3101中，用克隆PCR鉴定正确的菌株侵染本氏烟表皮细胞48 h，激光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光分布在烟草表皮细胞的细胞核膜和细胞质上，并且细胞核上的荧光比细胞质的荧光要强（图6）。

3结论与讨论

cab基因家族在长期进化过程中，cDNA序列是相当保守的[13]。同样的，番茄cab-1a基因作为LhcbI类基因成员[10]，其对应的蛋白序列与其他几个Cab基因蛋白序列的一致性在85%以上，进一步证明此基因在进化过程中是相对保守的。但是，由cab-1基因与cab-3基因编码的多肽相比，转运肽和N末端的结构域有明显差别，而其余部分的序列基本是相同的。因为cab基因编码的叶绿素a/b结合蛋白最终定位在叶绿体类囊体膜上，所以这段引导肽对其至关重要，由于这类蛋白的引导肽多位于蛋白序列的N端，所以，本研究只是将GFP蛋白序列添加到了其C端，不影响其正确的定位。

此外，本研究对Cab-1A-like蛋白的亞细胞定位结果表明，其位于细胞的细胞质和细胞核中，细胞质中的蛋白属于叶绿体内定位的蛋白或者是内质网和高尔基体上正在加工的不成熟蛋白；对于细胞核上的定位，大多位于细胞核核膜上，本研究猜测这可能是由于该蛋白引导肽与某个蛋白的核定位信号序列结构相似所致。

植物在长期进化过程中，不断抵御外部伤害，包括有害生物的入侵，其体内逐渐形成了一套完整的保护机制[14-15]，无论是针对细菌还是病毒，植物能抵抗绝大多数微生物的侵染，主要是因为植物细胞具有识别微生物保守分子模式的受体，这些受体能把胞外信号传递到胞内，触发植物的先天免疫反应。病原物在与植物的长期互作过程中进化出效应蛋白，这些效应蛋白能够抑制植物的先天免疫反应，从而使病原物可以成功地侵染特定的植物[16]。本研究在前期进行的酵母双杂交试验过程中发现，Cab-1A-like蛋白与马铃薯Y病毒HC-Pro蛋白相互作用，由于酵母双杂交系统的筛选存在假阳性结果[17-18]，使得本研究有必要对该蛋白作出进一步深层次的分子鉴定，为后续验证该蛋白质与马铃薯Y病毒蛋白相互作用机理奠定基础。endprint

参考文献：

[1]Green B R，Pichersky E，Kloppstech K. Chlorophyll a/b -binding proteins：an extended family[J]. Trends in Biochemical Sciences，1991，16（5）：181-186.

[2]汪仁，李晓丹，江玉梅，等. 石蒜捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的克隆和序列分析[J]. 江苏农业科学，2011，39（2）：42-44.

[3]孙钦秒，冷静，李良璧，等. 高等植物光系统Ⅱ捕光色素蛋白复合体结构与功能研究的新进展[J]. 植物学通报，2000，17（4）：289-301.

[4]Ganeteg U，Külheim C，Andersson J，et al. Is each light-harvesting complex protein important for plant fitness？[J]. Plant Physiology，2004，134（1）：502-509.

[5]Xu Y H，Liu R，Yan L，et al. Light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins are required for stomatal response to abscisic acid in Arabidopsis[J]. J Exp Bot，2012，63（3）：1095-1106.

[6]Liu Z F，Yan H C，Wang K B，et al. Crystal structure of spinach major light-harvesting complex at 2.72 A resolution[J]. Nature，2004，428（6980）：287-292.

[7]石蘭馨，张晓平，梁厚果. 捕光叶绿素a/b结合蛋白和cab基因[J]. 植物生理学通讯，1995，31（6）：470-476.

[8]Bennett J. Protein phosphorylation in green plant chloroplasts[J]. Annual Review of Plant Biology，1991，42：281-311.

[9]Jansson S，Pichersky E，Bassi R，et al. A nomenclature for the genes encoding the chlorophyll a/b-binding proteins of higher plants[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1992，10（3）：242-253.

[10]Pichersky E，Bernatzky R，Tanksley S D，et al. Molecular characterization and genetic mapping of two clusters of genes encoding chlorophyll a/b-binding proteins in Lycopersicon esculentum（tomato）[J]. Gene，1985，40（2/3）：247-58.[HJ1.7mm]

[11]Qiao G，Wen X P，Zhang T. Molecular cloning and characterization of the light-harvesting chlorophyll a/b gene from the pigeon pea （Cajanus cajan）[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2015，177（7）：1447-1455.

[12]杨成丽，刘树楠，周吉源，等. 高效烟草遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入[J]. 生物技术，2004，14（2）：9-11.

[13]向太和，王利琳，庞基良. 水稻（Oryza sativa L.）捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA的克隆和特性分析[J]. 作物学报，2005，31（9）：1227-1232.

[14]李春雷，倪德江. 氟对幼龄茶树叶绿素含量及抗氧化酶活性的影响[J]. 江苏农业学报，2015，31（5）：1149-1153.

[15]孙红炜，路兴波，杨崇良，等. 不同抗性玉米品种接种甘蔗花叶病毒（SCMV）后4种防御酶活性变化研究[J]. 植物病理学报，2006，36（2）：181-184.

[16]崔福浩. 丁香假单胞效应蛋白AvrRpt2抑制植物免疫分子机制的研究[D]. 北京：中国农业大学，2013.

[17]谌思. DND1与GRN相互作用的鉴定[D]. 长沙：湖南师范大学，2015.

[18]汪义龙，夏莹萍，梁建生. 水稻OsCATA基因相互作用蛋白的筛选和表达分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（8）：20-23.endprint