APP下载

组蛋白八聚体的装配及荧光标记检测体外组装核小体的效率

2017-10-10刘媛张凤慧赵宏宇

江苏农业科学 2017年14期
关键词:定位

刘媛 张凤慧 赵宏宇

摘要:基于影响核小体定位的DNA序列TA 10-bp周期性和R5Y5序列模体,设计6条对组蛋白亲和性不同的DNA序列,将其克隆到重组质粒中,分别命名为CS1~CS6。通过PCR扩增的方法,在引物上标记Cy3荧光信号分子,获得大量标有Cy3的目的序列;同时,从大肠杆菌中表达纯化了H2A、H2B、H3、H4共4种组蛋白,经复性装配成组蛋白八聚体,利用盐透析法将目的DNA序列与组蛋白八聚体组装成核小体结构;经荧光信号检测,分析6条目的序列形成核小体的能力。结果发现,CS2、CS3形成核小体的能力较强,该结果与Trifonov EN提出的核小体在该模体上的精确定位基本吻合,该试验方法的建立对核小体结构及相关表观遗传学领域的研究具有一定的意义。

关键词:核小体;组蛋白;荧光标记;序列模体;体外组装;定位

中图分类号: Q71文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2017)14-0012-05

表观遗传是后基因组时代的研究热点,其中核小体定位是重要的研究领域之一。它在真核生物细胞转录调控、DNA复制和修复等过程中扮演着至关重要的角色[1]。科学家们经过大量的试验研究发现,在所有对核小体定位有影响的因素中,DNA序列扮演着关键的角色[2]。近年来,有大量关于核小体定位的理论分析和预测,但大多没有进行直接的试验验证。体内试验易受到很多因素的干扰,因而体外重组核小体试验技术是研究核小体定位的有效手段之一。

影响核小体定位的DNA序列因素有TA 10-bp周期性、polyA、各种序列模体等[3]。其中以色列科学家Trifonov建立了多个理论模型,分析了线虫、人类等模式生物核小体定位特征,提出RRRRRYYYYY模体可能是一种具有强核小体定位信号的序列,其中R是嘌呤,Y是嘧啶[4-5]。本试验主要考虑了TA 10-bp周期性和R5Y5序列模体,构造了6条对蛋白质亲和力不同的DNA序列,标记为CS1~CS6,构建重组质粒,经过PCR扩增得到大量CS序列。同时,试验从含有组蛋白重组基因质粒的大肠杆菌中表达纯化出4种组蛋白,装配形成组蛋白八聚体。在体外将DNA序列与组蛋白八聚体在一定条件下进行组装形成核小体结构,建立了一种基于荧光标记检测核小体体外组装的试验方法,为后续研究奠定了基础。

之前试验采用Biotin标记方法检测核小体组装效率较为繁琐,6条序列组装后还须经过核小体电泳、转膜条件、紫外交联、封闭、加抗体、洗膜、加抗體、暗室曝片等步骤[6]。由于检测的信号需要多步转换,才能间接地反映核小体组装效率,而且难以量化,以至于结果存在较大误差。本研究在此基础上对核小体检测方法做了改进,试验的DNA直接进行荧光标记,组装后进行聚丙烯凝胶电泳检测,放入荧光化学凝胶成像系统中成像,根据荧光的强弱即可直观地判断大概结果,后期用专业软件读取数据就可计算得出组装率,从而使核小体定位的研究结果更加直观、简便、并且更精确可测。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种及质粒

试验所用菌株为Escherichia coli DH5α;质粒采用含有CS1~CS6的pUC 19重组质粒。

1.1.2主要仪器与试剂

仪器:PCR仪(2720 Thermal Cycler)、电泳仪(Bio-Rad)、台式多功能高速离心机(Eppendorf 5804R)、冷冻离心机(Eppendorf 5810R)、凝胶成像系统(Gene Genius)、紫外分光光度计(NanoDrop 1000)、层析柜(Thermo Revco)、荧光化学发光成像系统(Amersham Imager 600)。

试剂:酵母提取物、胰化蛋白胨购自英国OXOID公司,琼脂糖购自法国BIOWEST公司,NaCl、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自美国Amresco公司,胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司,DNA分子maker、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶购自日本Takara公司。

1.2方法

1.2.1目的序列信息

试验所用的6条目的序列中R表示腺嘌呤(A)或者鸟嘌呤(G),Y表示胸腺嘧啶(T)或者胞嘧啶(C)。在6条序列中,CS1只具有R5Y5序列模体特征;CS4~CS6只具有TA 10-bp周期性规律;而 CS2~CS3同时具备R5Y5模体和TA 10-bp周期规律。目的序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,直接连接到pUC19多克隆位点中的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ之间。

1.2.2目的序列扩增纯化

根据重组质粒的碱基序列,在CS序列2端设计引物,对CS1~CS6进行序列片段的扩增。

PCR扩增反应体系:5.0 μL 10×buffer,4.0 μL dNTP,2.0 μL 荧光引物,2.0 μL CS-R,3.0 μL Mg2+,0.3 μL DNA,rTaq 0.3 μL,ddH2O 33.4 μL。

PCR扩增反应程序:94 ℃、5 min;94 ℃、20 s,64 ℃、20 s,72 ℃、30 s,32次循环;72 ℃、10 min,4 ℃保存。

PCR扩增引物为上游引物:5′-ACGGCCAGTGAATT CGAGG-3′;下游引物:5′-GCCAAGCTTCTGAGATCGGAT-3′,其中,上游引物5′端标记Cy3荧光分子。

配制1.2%琼脂糖凝胶分别对CS1~CS6扩增的目的序列进行电泳检测,然后进行胶回收获取序列片段,胶回收采用生工生物工程(上海)股份有限公司的胶回收试剂盒。

1.2.3组蛋白的表达纯化

分别将含有组蛋白H2A、H2B、H3、H4基因重组质粒的单菌落接种于含有氨苄的LB培养基上,37 ℃、220 r/min培养至D600 nm值为0.4~0.6时加入IPTG进行诱导表达[7]。收集诱导表达后的菌体,用wash buffer重悬,再超声破碎细菌至菌体完全破裂,离心获取沉淀。加入wash buffer+Triton-X100重悬沉淀,离心去上清后,利用unfolding buffer充分溶解,离心获取沉淀,测定沉淀浓度。其中1×wash buffer的成分为50 mmol/L Tris-bash 6057 00 g,100 mmol/L NaCl 5.840 00 g,1 mmol/L EDTA-Na2 0.372 00 g,1 mmol/L 苯甲脒(benzamidine)0.156 61 g;unfolding buffer的成分为 7 mol/L 盐酸胍(guanidine hydrochloride)668.780 00 g,20 mmol/L Tris-base 2.422 80 g,10 mmol/L DTT 1.542 40 g。endprint

1.2.4组蛋白复性及八聚体装配

取5 mg H2A、H2B、H3、H4加入透析袋中,置于refolding buffer中透析,4 ℃搅拌12 h后,再换1次透析液,4 ℃透析24 h,将透析液取出,4 ℃、1 300 r/min 离心5 min,收集上清,再将样品浓缩至500 μL,过分子柱,收集片段。其中refolding buffer成分为2 mol/L NaCl 233.760 0 g、10 mmol/L Tris-base 2.422 8 g、1 mmol/L EDTA-Na2 0.744 5 g、5 mmol/L β-疏基乙醇 0.685 0 mL。

1.2.5核小体组装及其检测

将纯化的组蛋白八聚体与目的序列以一定的比例加入到含有2 mol/L氯化钠的TE缓冲液中混匀,总体系30 μL,加入透析管中,放入含2 mol/L氯化钠的TE透析液中透16 h,在此过程中用恒流泵将TE缓冲液匀速滴入透析液中,使其中氯化钠的浓度降到 0.6 mol/L;之后将透析管转入到不含有氯化钠的TE缓冲液中透析 3~6 h。

组装核小体的试验体系见表1,分别在组蛋白与DNA比例为0.6、0.8、1.0这3种条件下进行组装。组装后将样品的体积调整一致,分别用EB染色、考马斯亮蓝染色、Cy3荧光信号检测的方法分析组装效率及检测手段的灵敏度。

2结果与分析

2.1DNA序列扩增及纯化

目的序列克隆到载体上后,为大量获得组装核小体的DNA序列,采用PCR的方法对目的序列进行扩增。扩增后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色结果见图1。图1中M为DL1000 DNA Ladder marker,CS1~CS6序列条带位置为 100~200 bp之间,即得到电泳条带大小约为150 bp,这与目的序列的长度152 bp基本一致,说明条带位置正确(图1)。

对PCR扩增产物进行胶回收,回收后的样品采用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。由于PCR引物上标记有Cy3荧光分子,目的序列经扩增后在尾部同样带有熒光标记分子。用荧光化学发光凝胶成像系统拍像,结果如图2所示。图中CS1~CS6为纯化后的序列,电泳条带与理论值基本一致,且没有任何的污染,纯度较高。

2.2组蛋白的表达纯化

从大肠杆菌中表达4种重组组蛋白,经SDS聚丙烯凝胶酰胺电泳检测的结果见图3。H2A、H2B的分子量约为15 ku,H3的分子量约为17 ku,H4的分子量约为14 ku。纯化的组蛋白H2A、H2B、H3、H4条带位置正确,基本没有其他蛋白的条带存在,可用于后续试验。

2.3组蛋白复性及八聚体装配

将4种组蛋白以等摩尔比例进行复性透析,装配成八聚体分子结构。在复性过程中,分子间可能会发生团聚,也可能形成四聚体结构。为进一步纯化试验需要的组蛋白八聚体分子,采用凝胶层析的方法对样品进行纯化,洗脱曲线如图4所示。出现4个洗脱峰,其中第1个洗脱峰为大的团聚物,中间峰为组蛋白八聚体,最后1个峰为四聚体。将中间洗脱峰对应的样品用SDS聚丙烯凝胶酰胺电泳检测,结果见图5。从图5中可以看出,每个泳道中均呈现出3条条带,其中最上的条带为H3分子,中间为H2A和H2B的混合物,最下的条带为H4分子,条带的亮度与位置均符合理论预期结果。每个样品中都没有检测到杂蛋白的污染,纯度较高,可用于后续核小体体外组装试验。

2.4核小体组装及检测

为摸索组蛋白与目的DNA在不同比例条件下形成核小体的能力,分别采用0.6、0.8、1.0这3个不同的组蛋白与DNA序列的质量比进行组装核小体。

组装核小体后,首先采用EB染色和Cy3荧光标记检测手段分析样品。图6-A是检测荧光信号的结果,3个不同比例下,电泳中均呈现2条条带,其中下面的条带是没有形成核小体的游离DNA,上面的条带是形成核小体的DNA。将同一个凝胶电泳用EB染色检测的结果见图6-B,与荧光检测结果对应的位置都检测到了条带,但是EB染色的条带没有荧光信号检测的条带亮度高,说明EB染色的方法没有Cy3荧光标记检测手段灵敏。同时,从EB染色结果可以看出条带的大致位置,游离DNA的条带在100~200 bp之间,而核小体DNA由于组蛋白的存在,位于400 bp左右。3个不同比例下形成核小体的效率有所差异,随着组蛋白比例越大,形成的核小体条带越深。游离的DNA条带越浅,说明组装的核小体越多。用荧光标记检测出来的结果条带清晰、灵敏,用EB染色后图片中显示出来的并不灵敏,组蛋白的结合在一定程度上影响了EB的染色效果,所以一般采用荧光标记来检测。

为进一步从组蛋白的角度检测组装的核小体,分别采用荧光标记检测和考马斯亮蓝染色检测体外组装核小体的结果,图7-A所示是Cy3荧光标记检测的结果。对凝胶进行考马斯亮蓝染色后,在核小体对应条带位置也呈现出蛋白条带(图7-B),说明组蛋白与DNA有效地装配成了核小体。

试验以CS3序列为组装核小体的试验DNA模板,进行3个不同比例的组装条件摸索,均有效地形成了核小体结构。在后续对多条序列同时进行组装核小体时,考虑到多条DNA序列对组蛋白亲和性的差异,选择在组蛋白与DNA比例为0.8的条件下进行组装试验,使得形成的核小体既不过分饱和,同时又能体现出各条序列组装核小体的差异。

2.56条CS序列组装核小体效率的对比

为进一步对比6条CS序列组装核小体效率的差异,在同样的试验条件下,同时组装核小体结构,Cy3荧光信号检测结果见图8。从图8中可以看出,6条序列的泳道中均出现2条条带,分别是核小体DNA和游离DNA,表明均能有效地形成核小体。但是每一条序列的核小体DNA和游离DNA相对亮度不同,例如,CS2、CS3泳道中核小体DNA条带相对较亮,而CS1、CS6泳道中核小体DNA条带相对较弱,说明它们形成核小体的能力存在差异。endprint

利用凝胶成像定量分析软件Image Quant TL,将泳道中的条带分别定量化处理,读取相对数值,计算6条序列组装核小体过程中吉布斯自由能的变化, 进而评价各条序列对组蛋白的亲和性。定义未形成核小体的自由DNA为VD,形成核小体的DNA为VN,则反应过程的表观平衡常数Keq=VN/VD,吉布斯自由能变化ΔG0=-RT ln(Keq),以CS1为对照序列,相对吉布斯自由能变化ΔΔG0=ΔG0样本-ΔG0对照[3]。

组装核小体过程的吉布斯自由能计算结果见表2。CS2和CS3的相对吉布斯自由能最小,说明这2条序列对组蛋白的亲和性最大,在同等条件下,越易形成核小体[8-9]。

3结论与讨论

体外组装核小体是研究核小体定位及染色质结构相关领域常用的一种技术手段。目前主要通过2种策略有效地组装核小体,一种是利用如NAP或ACF等染色质重塑因子的作用,使DNA序列缠绕到组蛋白上,该过程需要消耗能量[10]。另一种是本试验中使用的,由于组装过程中不需要其他蛋白因子的参与,仅依赖盐浓度的变化驱动核小体的装配,所以组装核小体的效率只与DNA序列的特征有关,在研究DNA序列影响核小体定位时,该方法具有较大的优势[11]。

体外组装核小体结构后,如何灵敏地检测核小体形成效率是一个关键问题。其中最为便利的检测手段是EB染色方法,但是EB染色的灵敏度较低,对于核小体组装能力差的DNA序列,会导致较大的误差。同位素标记是灵敏度非常高的一种检测手段,但是在组装核小体的试验中,由于需要大量的摸索条件,需要一次性制备大量的DNA序列,从摸索组装核小体的比例等条件到多条序列组装核小体能力的相互对比,往往试验周期较长,而同位素的半衰期又较短,这就限制了试验的进度,且同位素标记试验需要在专业的实验室才能完成[12]。另一种检测手段是笔者所在课题组前期使用的生物素标记方法,将组装核小体的DNA序列标记生物素分子后,检测时需要转膜、抗体识别、底物反应、曝光胶片等步骤,较为繁琐的试验步骤容易放大误差[6]。本试验采用荧光分子Cy3标记在PCR引物的5′端,在序列准备时,非常方便地获得大量标记Cy3的目的DNA序列,组装核小体的样品经电泳后,直接在荧光凝胶成像仪中激发荧光信号成像,既灵敏又简洁方便,同时克服了上面几种方法的缺点。

试验中设计的6条序列,CS2、CS3同时具有TA 10-bp周期和R5Y5模体规律,而CS1没有TA 10 bp规律,CS4~CS6没有R5Y5模体规律,理论上讲,CS2、CS3对组蛋白的亲和性最高,同样条件下组装核小体的效率最大。经过组装核小体的试验结果分析,电泳的结果显示CS2、CS3形成核小体相对较多。吉布斯自由能的结果发现,CS2和CS3序列形成核小体过程中吉布斯自由能最小,说明这2条序列更加倾向于核小体的形成,验证了笔者设计序列的理论基本是正确的。

总之,本研究利用盐透析方法,建立了1套体外组装核小体的试验体系,发展了一种荧光标记检测核小体组装效率的手段。该方法可灵敏、便利且定量化地分析不同DNA序列核小体的效率。该方法的建立对核小体定位及染色质结构相关领域的研究具有重要的意义。

参考文献:

[1]刘辉,壮子恒,关佶红,等. 核小体定位的转录调控功能研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展,2012,39(9):843-852.

[2]蔡禄,赵秀娟. 核小体定位研究进展[J]. 生物物理学报,2009,25(6):385-395.

[3]王成爱,赵宏宇,邢永强,等. 酿酒酵母核小体定位理论模型的体外实验验证[J]. 生命科学研究,2014,18(1):21-27.

[4]Trifonov E N. Base pair stacking in nucleosome DNA and bendability sequence pattern[J]. Journal of Theoretical Biology,2010,263(3):337-339.

[5]Trifonov E N,Nibhani R. Review fifteen years of search for strong nucleosomes[J]. Biopolymers,2015,103(8):432-437.

[6]趙宏宇,柴荣,王成爱,等. 盐透析体外组装核小体及检测方法[J]. 河南师范大学学报(自然科学版),2014,42(1):133-136.

[7]柴荣,赵宏宇,蔡禄. 与人遗传病相关的DNA重复序列的体外核小体定位特性[J]. 基础医学与临床,2013,33(3):314-319.

[8]Volle C B,Delaney S. CAG/CTG repeats alter the affinity for the histone core and the positioning of DNA in the nucleosome[J]. Biochemistry,2012,51(49):9814-9825.

[9]Travers A,Hiriart E,Churcher M,et al. The DNA sequence-dependence of nucleosome positioning in vivo and in vitro[J]. Journal of Biomolecualr Structure & Dynamics,2010,27(6):713-724.

[10]Gemmen G J,Sim R,Haushalter K A,et al. Forced unraveling of nucleosomes assembled on heterogeneous DNA using core histones,NAP-1,and ACF[J]. Journal of Molecular Biology,2005,351(1):89-99.

[11]Korber P. Active nucleosome positioning beyond intrinsic biophysics is revealed by in vitro reconstitution[J]. Biochemical Society Transactions,2012,40(2):377-382.

[12]蔡禄,赵秀娟,刘国庆,等. 表观遗传学前沿[M]. 北京:清华大学出版社,2012:191-192.endprint

猜你喜欢

定位
《导航定位与授时》征稿简则
Smartrail4.0定位和控制
银行业对外开放再定位
一种新型回转定位锁紧装置
少儿智能定位鞋服成新宠
找准定位 砥砺前行
基于RFID的室内无线定位识别系统
基于S120的拧紧机定位控制系统的设计
青年择业要有准确定位
说定位:如何挖到第一桶金