生物质木质素分离和结构研究方法进展

文甲龙，陈天影，孙润仓

(北京林业大学林木生物质化学北京市重点实验室，北京 100083)

生物质木质素分离和结构研究方法进展

文甲龙，陈天影，孙润仓*

(北京林业大学林木生物质化学北京市重点实验室，北京 100083)

木质素是自然界中最丰富的可再生芳香族聚合物，其高附加值化利用可减少目前木质素资源燃烧所导致的资源浪费和环境污染。生物质细胞壁中三大组分(纤维素、半纤维素和木质素)通过共价键和氢键形成了致密而复杂的细胞壁结构，使得木质素难以高效分离。若要实现生物质木质素高效分离，首先需明确原料中木质素的分子结构特点和活性基团。基于木质素结构明确的生物质原料才能够更有效地选择和开发木质素解离及解聚方法。笔者主要概述了目前结构分析用的木质素分离和结构分析方法研究进展，重点阐述了液体核磁共振技术在分离木质素定性和定量结构方面的应用，并基于目前的研究进展提出了该领域的研究趋势。总之，木质素的结构解析将为树木基因调控、林木遗传育种和木质纤维原料的生物炼制提供相关理论依据。

木质素；分离纯化；结构分析；核磁共振技术

木质素广泛存在于高等植物中，是仅次于纤维素的第二大生物质资源,占植物体总质量的20%～30%。木质素通过与半纤维素和纤维素形成共价键和氢键的形式连接在一起，共同构成植物的木质部。在植物生长发育过程中，木质素不仅提供植物组织机械支撑，保护细胞壁免受生物降解，而且能够促进植物中的水分传输。以植物纤维为原料的行业，如制浆造纸和燃料乙醇均有木质素残渣排放。据统计，目前全球化学浆产量每年约为1.5亿t，同时产生木质素0.7亿t。由于制浆工业木质素纯度较低，且结构复杂，因此木质素产品的开发进展较为缓慢，只有少部分高品质工业木质素(木质素磺酸盐)被开发为表面活性剂等产品，而约95%以上的木质素直接用于燃烧获取热量，这造成了大量资源浪费，并产生环境问题[1-2]。另外，目前的纤维素乙醇产业也产生大量发酵残渣木质素，如何将残渣木质素高效经济地转化为能源和化学品是目前面临的科学难题[3]。不同的生物质原料和预处理手段导致残渣木质素结构特点和反应活性存在差异，因此需对残渣木质素结构进行深入研究，进而有针对性地选择和开发相应转化方法，实现资源的高效转化利用。此外，在木质纤维原料预处理技术开发过程中，由于木质素是构成生物质原料“抗降解屏障”最为重要的因素[4]，木质素的存在使得细胞壁三大组分难以有效解构和解离，进而降低生物炼制总体效率。因此，研究生物质原料中木质素化学成分和结构特点既是破除生物质“抗降解屏障”的基础，又可为生物质原料中主要组分高效解构提供方法和技术支撑。笔者对木质素分离和结构分析方法的研究进展进行了评述，提出了该领域的未来研究趋势。

1 木质素基本结构

木质素是自然界中含量最为丰富的可再生芳基化合物资源，其芳环聚合物结构中主要包含甲氧基、酚羟基、醇羟基、端基醛等官能团[5]。木质素基本结构是由对香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)和芥子醇(sinapyl alcohol)3种前驱体物质在酶的作用下经脱氢聚合及自由基偶合形成的木质素立体大分子结构，与前驱体对应的对羟苯基(H)、愈创木基(G)和紫丁香基(S)(图1)构成了木质素的3种基本结构单元。此外，木质素结构中还含有其他前驱体结构，如对羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸等[6]。在木质素前驱体聚合过程中，木质素单体之间主要形成芳基醚键(α-O-4′,β-O-4′)、树脂醇(β-β′)、苯基香豆满(β-5′)、螺环二烯酮(β-1′)等基本连接键(图2)。除这些连接键外，木质素与碳水化合物间也存在一定程度的化学交联，主要连接类型有苄基醚键、γ-酯键、苯基糖苷键等(图2)。其中，禾本科植物原料的木质素主要通过阿魏酸的桥接作用与碳水化合物产生交联[7]。虽然木质素的结构单元和连接方式已基本明确，但对于不同原料而言，木质素结构的准确信息主要受到木质素分离方法和分析手段的影响。因此，获得具有代表性的木质素样品对于准确解析木质素结构信息更为有利[8-9]。

图1 木质素3种前驱体及相对应基本结构单元Fig.1 Primary precursors and phenylpropanoid units of lignin

图2 常见木质素连接键及木质素碳水化合物连接键Fig.2 Common linkage of lignin and lignin-carbohydrate complex (LCC) linkages

2 木质素分离研究

2.1 一般木质素分离

用于结构表征的木质素，按照分离原理大致分为两类[10]：一类为溶解类木质素，即采用有机溶剂(例如1,4-二氧六环)从球磨的生物质原料中溶解出木质素，经纯化后用于结构表征，目前用于结构分析的木质素大多数属于这一类；另一类为残渣木质素，即采用酶水解(纤维素酶和半纤维素酶)方法去除绝大部分碳水化合物，而保留生物质原料中残渣木质素，但由于残渣木质素样品中含有少量未水解碳水化合物，从而导致其溶解度较差，因此该样品一般不能用于木质素结构分析。

一般情况下分离过程中结构变化小、得率高、代表性强的木质素样品更适用于木质素的结构分析。通常采用96%的1,4-二氧六环抽提球磨的生物质原料，经分离纯化后得到木质素样品进行结构分析。1956年研究人员提出了磨木木质素(MWL)的制备方法[11]。该方法一直被研究人员用来分离原本木质素，用于某种植物中木质素结构表征。但由于传统的MWL得率相对较低，且其得率与球磨方式和时间密切相关[12]，因此需要对该方法进行改进。研究人员采用纤维素酶处理球磨木粉除去大部分碳水化合物，酶解后的残渣再用96%的1,4-二氧六环提取得到纤维素酶解木质素(CEL)。研究结果显示，在结构上CEL与MWL较为相似，但CEL得率明显高于MWL，因此CEL较MWL更能代表原本木质素[13]。然而，纤维素的高结晶结构和不可及性较大地影响了酶水解效率，从而导致酶水解残渣中仍有部分不能水解的碳水化合物。为克服该困难，酶解前的预润胀处理受到研究人员的广泛关注，如采用有机溶剂(二甲基乙酰胺/氯化锂)先预润胀或溶解球磨后的木粉，再逐滴加入水或乙酸乙酯中再生，随后用纤维素复合酶处理再生后的残渣[14]。预润胀可降低纤维素结晶度，在一定程度上提高再生细胞壁的酶解效率，增加酶水解木质素的得率，但此方法在前期预润胀过程中会损失少量木质素片段。2003年，根据苯基糖苷键、酯键、苄基醚键等木质素-碳水化合物复合体(lignin-carbohydrate complex,LCC)联接键可在弱酸条件下部分断裂，研究人员提出了一种新的木质素分离方法[15]。该方法采用0.01 mol/L盐酸和85%的二氧六环水溶液对酶水解残渣进行加温提取(86℃)，制备得到的木质素被命名为酶解-温和酸解木质素(EMAL)。经对比研究发现，利用温和酸解分离得到的木质素较传统的MWL和CEL得率高，纯度高[15]，且在 EMAL提取过程中少量木质素与碳水化合物复合体的联接键发生了断裂，而木质素大分子内的各主要联接键并无明显断裂[15]。上述方法一般适于木材类生物质，而草类原料中由于存在羟基肉桂酸交联结构，导致其木质素得率和纯度相对较低。在草类原料中，对香豆酸一般以酯键连接在木质素侧链的位置，而阿魏酸分别和半纤维素与木质素以酯键和醚键相连，形成交联的桥式结构。针对这些特殊的交联结构，研究人员提出了不同梯度条件下的温和碱处理草类原料，并对得到的不同木质素组分结构进行表征[16]。该方法利用碱处理断裂木质素与碳水化合物之间对碱敏感的联接键，使大部分木质素与碳水化合物分离，然后通过溶解和沉淀方式分离木质素组分。上述方法均涉及溶剂提取和木质素的酸析沉淀分离。Wen等[17]以桉木为原料，提出了基于室温弱碱处理结合原位酶解的“全木质素”的制备方法，得到以残渣形式保留下来的弱碱润胀酶解残渣木质素(SREL)，并对该残渣木质素进行全面的结构研究。相比较而言，用于提取CEL的酶水解残渣由于未能预润胀而导致酶水解效率有限，最终使得残渣木质素在氘代试剂中的溶解度较差而无法进行后续分析。研究发现，SREL的得率(95%)明显高于同等条件下的碱木质素(AL，12%)和纤维素酶解木质素(CEL，20%)，且SREL 含糖量(8.7%)相比同等条件下的CEL(13.4%)低[17]。通过元素分析、凝胶渗透色谱(GPC)、二维碳氢相关谱、磷谱和分析热解技术对上述木质素进行全面表征，同时定量比较这些木质素中的主要联接键。核磁结果显示，SREL与相应CEL比较，紫丁香基含量高，且含有大量的β-O-4′ 联接，酚羟基含量少，与传统的酶木质素CEL、碱木质素AL的化学组成和结构相似[17]。为避免弱碱预润胀对木质素中某些特定结构(酰化单元)造成破坏，研究人员对SREL方法进行了改进。Chen等[18]提出了一种基于两次球磨和两次酶解的残渣木质素制备方法，该方法分离的木质素具有得率高、代表性强、含糖量低、结构完整、在氘代试剂中溶解度好等优点，是目前较为理想的结构分析用的木质素样品。总之，上述残渣木质素可以作为一种较有潜力的原本木质素分离方法应用于木质素结构研究中，同时该方法制备的木质素有助于全面鉴定植物细胞壁中全部木质素的结构特征，且该木质素能够作为“木质素参照物”，从而促进植物细胞壁解构和木质素解聚技术更加有效地开发。

2.2 生物炼制过程中特定结构木质素的分离提取

近年来，木质素催化降解相关研究受到广泛关注，相关研究进展在文献中已有详细介绍[19]。事实上，由于木质素来源和分离方法不同导致木质素的结构差异，从而导致催化降解性能也不尽相同。有研究认为木质素中的β-O-4′ 联接键含量可能影响木质素降解产物的生成和分布，该研究认为预处理过程中得到含有较高比例β-O-4′ 联接键的木质素，有利于木质素的后续催化降解[20]。此外，低浓度硫酸辅助的γ-戊内酯水溶液可以从木质纤维素中提取出得率较高(约70%)、结构较为完整的木质素(芳基醚键含量较高)。研究人员将这种特定结构的木质素用于木质素催化降解，发现木质素单体产率明显提高[21]。近年来，研究人员对传统的酸性二氧六环提取木质素进行改进，即在提取过程中加入甲醛，发现加入甲醛使得木质素的侧链形成一个含有六元环的特定结构，该结构能有效阻止木质素在提取和降解过程中的再缩合，最终实现该种特定结构木质素的高效催化降解[22]。总之，初始木质素的结构和后续的催化降解存在相关性，此方面需进一步研究。

3 木质素结构分析技术进展

木质素的结构分析是木质素研究的难点和重点，也是木质素转化为材料和化学品的前提。

随着分析方法的进步，研究人员对木质素结构的认识和理解更加准确和全面。在几十年的研究中，木质素化学家相继发展了不同的化学降解方法、色谱技术和波谱技术，从而使木质素的结构研究更加准确。一般地，木质素的结构分析方法包括化学降解法和波谱法两类。化学降解法主要包括硝基苯氧化法、高锰酸钾氧化法、臭氧氧化法、酸水解法、硫醇酸解法、衍生化还原降解法(DFRC，derivatization followed by reductive cleavage)等；波谱法主要包括各种光谱技术，如紫外吸收光谱(UV)、傅里叶红外吸收光谱(FT-IR)、拉曼光谱、核磁共振吸收光谱(1H NMR，13C NMR，31P NMR，2D-HSQC NMR)等[23]。

3.1 化学降解方法

硝基苯氧化法是研究木质素苯环结构的有效手段之一，该方法基于木质素中β-芳基醚键的断裂而形成芳环单体，进而反推木质素的组成(如S/G/H比例)。由于硝基苯氧化无法断裂木质素中的C—C键，因此，该方法只能测定非缩合木质素(β-芳基醚)中的愈创木基丙烷、紫丁香基丙烷和对羟基苯丙烷的比例。高锰酸钾氧化法则对木质素侧链进行选择性氧化，产物为芳香羧酸及其他脂肪族羧酸的混合物。通过分析降解产物，可以得到木质素苯环结构以及苯丙烷结构单元间的连接方式、出现频率等信息，但高锰酸钾氧化法只能对样品进行定性分析。臭氧氧化法主要通过臭氧氧化降解木质素，然后通过分析木质素降解产物确定木质素侧链的立体化学。臭氧氧化法是将芳环氧化断裂，通过与模型物比较，从而得到侧链赤型与苏型的比例，该法主要对木质素β-O-4′ 联接型的立体结构进行分析。酸水解法是在含 0.2 mol/L HCl 的体积分数为90%的二氧六环-水溶液中回流得到一系列木质素降解产物，以此确认木质素中存在β-5′ 和β-O-4′ 连接。硫醇酸解法为酸解法的改良方法，其优点在于可发生选择性较强的断裂反应，并能形成高得率且可辨别的产物。但硫醇酸解法对实验室条件要求较高，且需用到有恶臭气味的乙硫醇，而且只能检测β-O-4′ 键型连接的结构单元。衍生化还原降解法(DFRC)可以选择性地断裂木质素中芳基醚键，得到乙酰化的木质素单体，该方法没有硫醇酸解法的恶臭味，是对硫醇酸解法的改进[24-25]，但该法采用GC-MS定量测定木质素降解产物时受到较大限制，每个降解产物均需合适的校正因子才可实现定量。校正因子需要用每一个降解产物的标准样做标准曲线校正，增加了操作难度，但上述降解方法均只反映非缩合木质素部分的结构特点，对木质素缩合部分结构的推断仍存在一些问题。近年来，裂解气相色谱/质谱(Pyrolysis-GC/MS)技术也被应用到木质素的结构分析中，该技术是在无氧条件下，将样品快速裂解气化并通过GC分离，然后被MS识别来确定木质素裂解单体结构，进而反推出木质素的S/G比例[26]。这种方法对仪器的灵敏度要求较高，且在不同条件下裂解的木质素产物有所不同，难以对木质素进行准确定量分析[27]，只适合对木质素S/G比例的快速分析。

3.2 紫外吸收光谱(UV)

木质素中存在一些对紫外线有很强吸收的发色基团，而植物中其他组分(纤维素和半纤维素)几乎不吸收紫外线，因此，可以利用木质素的这一特性来研究木质素的特定结构。主要由愈创木基单元组成的针叶材木质素的最大吸收峰位于280～285 nm附近，阔叶材的最大吸收峰位于275～279 nm附近，草类原料中的木质素由于含有交联的羟基肉桂酸(对香豆酸和阿魏酸)，除了出现275～279 nm之间的吸收峰，图谱中还会出现位于310～320 nm的羟基肉桂酸吸收峰。

3.3 傅里叶红外吸收光谱(FT-IR)

物质分子中各基团在不同波长下对红外光的吸收特性不同，根据这一原理，研究者使用红外吸收光谱对物质的分子结构和化学组成进行解析，也根据结构分析鉴定未知化合物。FT-IR可在短时间内对物质结构进行分析，且具有灵敏度高、稳定性好、使用和数据处理方便等优点[28]。木质素化学家Faix[29-30]利用傅里叶变换红外光谱对木质素的结构进行了大量研究，在木质素的结构分析方面取得了较大进展。木质素的红外信号归属如下：3 750～3 000 cm-1代表OH的伸缩振动，2 922 cm-1信号峰是由于—CH2的伸缩振动引起的，1 740～1 655 cm-1为C—O伸展振动，1 430，1 510和1 600 cm-1为芳环振动，1 333 cm-1可能为紫丁香基型，1 230～1 210 cm-1为CO伸展，1 167 cm-1为共轭酯的联接信号峰，1 050～1 020 cm-1为CO变形、伯醇羟基和甲氧基。红外光谱在木质素的快速定性分析和纯度判断中具有一定优势，但其不能获得更详细的结构信息，达不到当前对木质素结构更详细的分析要求。

3.4 拉曼光谱 (Raman)

拉曼光谱和傅里叶红外光谱均依赖于分子振动光谱，在木质素分析方面和傅里叶变换红外光谱相互补充。1999年研究人员采用傅里叶变换拉曼(FT-Raman)对木质素进行分析，可以对磨木木素和不同原料(山杨、松木、云杉和甘蔗)酶解木质素的结构进行定性研究[31]。Larsen等[32]将FT-Raman光谱学和密度泛函理论(DFT)相结合，并通过木质素模型物单体得出了S、G、H型木质素单体的振动模式库，他们发现溶剂和实验条件也会影响拉曼光谱带的形状和位置。Meyer等[33]采用近红外拉曼分光光度计(NIR Raman)分析原料和醇提取过的原料，得到抽提物存在对木质素峰位置影响的规律。共聚焦拉曼显微镜可以在没有染色或化学预处理条件下揭示木质素在生物质细胞壁中的空间分布规律[34]。近年来，Saar等[35]使用受激拉曼散射(SRS)显微镜研究原料中木质素在不同的预处理条件下降解规律。紫外共振拉曼光谱(UVRR)能原位地分析细胞壁中木质素结构和变化情况，研究人员采用其定性地研究温度和pH对木质素降解的影响[36]。相干反斯托克斯拉曼(CARS)显微镜不受荧光干扰，且能够提供较强的木质素信号，目前，研究者通过CARS研究了桦木、橡树和云杉样品的木质素化学结构[37]。拉曼技术的进步使木质纤维素样品的结构研究得到进一步发展。

3.5 核磁共振波谱 (NMR)

液体核磁共振技术是目前木质素结构表征中最为先进和可靠的方法，一般情况下，1H NMR谱、13C NMR谱、定量31P NMR[38-39]和二维异核碳氢相关谱(2D-HSQC NMR谱)[23]是木质素结构分析较常用的方法。液体核磁共振技术通常表征分离和纯化后的木质素样品。随着高场液体核磁共振技术和超低温冷冻探头技术的发展，研究人员采用二维碳氢相关谱技术(2D-HSQC)直接表征植物细胞壁中木质素的结构特点。该方法采用特定的氘代试剂直接溶解或者润胀球磨的细胞壁组分，再通过二维核磁进行表征，理论上可有利于得到细胞壁中木质素较为完整的结构信息，但目前的全溶体系主要用来快速得到细胞壁中木质素的S/G值，而对于木质素精细结构的鉴定仍需分离纯化的木质素样品。细胞壁全溶技术尚存在两点不足：1)木质素侧链区的信号易受细胞壁多糖信号干扰。2)氘代全溶体系的制备和溶解效果有待改善。全溶体系下木质素的相关研究进展已在文献中详述[23]。

3.5.11H NMR

1971年Sarkanen等[40]首次出版了较为全面的有关核磁共振(主要是1H核磁共振)应用于木质素结构分析的专著。但20世纪70年代核磁共振设备场强较低，导致1H NMR谱图信号较宽且粗钝；另外木质素分子结构复杂，使得1H NMR谱峰存在大量重叠信号，难以进行准确解析。目前,由于氢谱采样时间短、谱图信号强等优势，氢谱尚可用来快速分析木质素样品纯度和基本结构类型等信息,但要深度解析更为详细的木质素结构信息，则需要其他核磁高级实验。

3.5.213C NMR

与1H NMR相比，13C NMR分辨率更高，但13C NMR中13C原子核的丰度较低，因此为提高图谱灵敏度，需延长采样时间，增加采样次数，提高样品浓度，方能得到较为满意的图谱。木质素大分子结构中的芳基醚键、缩合和非缩合的结构单元、甲氧基等结构信息均可从13C NMR谱图获得。采用定量13C NMR模式(程序：C13IG，反向门控去耦法)对木质素的官能团(甲氧基，β-O-4′含量，C—C键，C—O键和C—H键含量)进行定量计算[41]，可定量比较预处理过程中木质素的结构变化规律以及潜在的断裂机理。20世纪80年代以来，脱木质素机理和残留木质素的结构分析开始用到13C NMR技术，相关内容在Ralph等[42]撰写的专著中有详细介绍。

3.5.331P NMR

31P NMR最早被应用于测定机械浆中醌型结构研究，随后Mazúr等[43]采用31P NMR定量研究分离的木质素不同类型的羟基。磷谱的自然丰度为 100%，具有较高的灵敏度，且信号峰都为无耦合的单峰。31P NMR方法在检测木质素不同类型羟基方面具有较强优势，它可以在相对较短时间和较低实验浓度条件下获得木质素中各种类型羟基的定量信息。磷化试剂2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧膦杂戊环(2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane,TMDP)与木质素中的不同羟基反应，形成含有磷元素的木质素衍生物，随后加入内标，即可利用磷谱(31P)定量测定木质素样品中的酚羟基、脂肪羟基、羧基等特征的官能团的含量。研究者将磷谱技术广泛应用于木质素羟基官能团的定量研究，如三倍体毛白杨纤维素酶解木质素(CEL)的磷谱(图3)[18]。此外，Wen等[44]将31P NMR方法用于研究木质素在离子液体([C2mim][OAc])预处理中的结构变化，发现随着温度的升高，木质素酚羟基和醇羟基呈现有规律的变化，辅助证明了木质素相继发生了芳基醚键的断裂，侧链的脱水和氧化等反应。

环己醇为内标，磷化试剂为TMDP图3 毛白杨纤维素酶解木质素(CEL)的磷谱Fig.3 Quantitative 31P NMR spectrum of poplar cellulolytic enzyme lignin (CEL)

3.5.4 异核单量子相关谱(2D-HSQC NMR)

异核单量子相干核磁共振光谱(2D-HSQC，heteronuclear single quantum coherence NMR)能较好地区分氢谱和碳谱中重叠的信号峰，它结合了1H NMR实验的信号检测灵敏度和13C NMR谱图谱宽范围大、分辨率高等优势，可有效地分析复杂样品的结构特点[23,45]。木质素2D-HSQC谱图一般由异头碳区、侧链区和芳香环区3个区域组成。异头碳区主要为多糖之间的各种联接键，展现木质素样品中多糖的联接键种类以及部分LCC键结构信息，在此不做详细介绍，详见相关内容的综述论文[46]。

木质素2D-HSQC谱图的侧链区(也称联接键区域)包含甲氧基、β-O-4′、β-β′、β-5′、β-1′等各种联接键以及苄基醚键(BE)等与木质素相连的碳水化合物联接键相关信号(图4)[45-46]。Rencoret等[47]研究了不同桉木磨木木质素结构，通过半定量方法得出主要连接键为β-O-4′，约占总连接键的66%～72%，其次为β-β′和β-5′，约占16%～19%。Du等[48]发现漆酶介质体系通过木质素-碳水化合物分离脱除木质素，并采用2D-HSQC技术表征木质素脱除过程中的结构变化，同时对苄基醚键、苯基糖苷键等木质素-碳水化合物键进行了研究，相比之下， 2D-HSQC图谱的芳香环区域能够提供木质素基本结构单元及一些末端基(如对香豆酸、阿魏酸、对羟基肉桂醇末端基、肉桂醛末端基等)的结构信息。此外，在芳香环区域，木质素样品的S/G比例可根据S单元2，6号位和G单元2号位的信号积分强度比值计算。Rencoret等[47]采用2D-HSQC技术对不同生长年限的桉木磨木木质素(MWL)结构和组成进行了研究，发现木质素的S/G比例随树龄的增长而升高，说明桉树木质化过程中S型单体显著增加。Bauer等[49]通过2D-HSQC中S/G的变化研究了乙醇溶剂浓度和回流时间对分离芒草木质素的影响，发现乙醇提取会导致木质素侧链α位置部分改性(α-乙氧基化)。Bunzel等[50]采用2D-HSQC NMR技术对猕猴桃、梨子、大黄叶柄和麦麸纤维中提取的木质素进行表征，通过他们已建立的木质素模型物数据库进行归属，但对麦麸木质素尚未完全解析，因此，有必要探索准确度更高、种类更全的木质素结构研究数据库。

图4 不同生长年限桉木的磨木木质素二维碳氢相关谱(2D-HSQC)Fig.4 The 2D-HSQC spectrum of milled wood lignin isolated from Eucalyptus globulus wood samples at different growth stages

通过2D-HSQC NMR技术的定量积分功能，可以实现木质素成分(S/G比例)和各种化学联接键的定量分析。核磁定量分析在预处理机理和木质素降解研究方面具有重要作用。目前，主要通过3种核磁定量方式对木质素结构进行系统定量，下面主要介绍这几种定量方式：

1)半定量(无内标)[23]。半定量方式可以计算每种联接键单元在全部联接键中的相对比例，它是2D-HSQC中较为常见的定量方式(归一化法)。但该定量方式只适用于计算某一个木质素样品中各种联接键的相对含量，而不能比较不同木质素样品中某一种联接键含量的多寡。

2)相对定量(内标为芳环C9单元)[23]。目前这种相对定量方法应用较为广泛。由于木质素的IC9单元(芳环区域)在预处理过程中可认为相对不变，根据木质素中各种联接键含量变化可推测木质素的结构转化机理。一般针叶材和阔叶材以木质素的G2和0.5S2,6+G2作为内标，而草类木质素中，将0.5S2,6+G2+0.5H2,6定为内标。

3)基于定量13C和2D-HSQC的绝对定量。Zhang等[51]将定量13C谱和2D-HSQC谱相结合，并找到合适的内标信号对木质素的结构进行定量表征，利用这一内标可以将2D-HSQC谱图上相对积分值转化为绝对值。取定量碳谱上δ78～90区间的积分值为绝对积分值，再以二维相应部分(δ78～90/2.5～6.0)的相关信号计算出每个联接键单元的半定量比例(定量方式1，半定量模式)，最后根据定量碳谱的绝对值进行转化，最终确定每种结构单元的绝对数值。该方法能够克服碳水化合物对木质素信号的干扰。研究表明，三醋酸纤维素、MWL和LCC样品的定量表征也可通过此方法完成[51-52]。

4 展 望

研究人员针对不同生物质类型，在原本木质素分离方法和结构分析方面已经开展了较为深入的研究工作，并取得较大进展，已基本明确大部分生物质原料的木质素结构特点。随着生物质预处理技术和木质素综合利用技术的发展，木质素化学需进一步发展以适应当前快速准确分析木质素成分和结构的要求。为较好地适应木质素结构分析的要求，尚需在以下两方面加强研究：

1)原本木质素的高效分离与纯化。木质素和其他组分间复杂的交联结构使得木质素以“结构完全不变的形式”分离出较为困难。另外，在条件剧烈的分离过程中，天然木质素中的酚羟基等活性基团，易发生氧化和缩合反应。因此，在结构分析用的木质素样品分离中，应尽量避免破坏木质素的原始结构，采用中性溶剂(二氧六环水溶液)以高得率提取植物细胞壁中的木质素。此外，还可采用球磨处理结合高效的纤维素复合酶水解去除球磨植物细胞壁中的绝大部分碳水化合物，将细胞壁中的木质素大分子以“残渣木质素”形式留下，再经过洗涤纯化步骤，得到高得率、高代表性的酶水解残渣木质素，该木质素可直接用于木质纤维原料中木质素的结构分析，而无需进行进一步溶剂提取。由于该方法得率较高、代表性强，在原始木质素分离中将呈现出较好优势。

2)木质素精确结构测定方法的开发。分析仪器和分析方法的进步将为研发新的木质素精确分析方法提供有利条件。目前，基于高分辨率液体核磁技术和相关核磁实验方法(HSQC、HMBC等)在木质素结构定性和定量分析方面的应用将更加有利于木质素结构的深入解析；同时，结合较具有代表性的木质素制备方法(残渣木质素)，采用配备超低温探头的高场核磁技术对木质素结构进行深入解析，将为树木基因调控、林木遗传育种和木质纤维原料精炼领域研究提供依据。

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Research progress on separation and structural analysis oflignin in lignocellulosic biomass

WEN Jialong,CHEN Tianying,SUN Runcang*

(Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Lignin is the most abundant renewable aromatic polymer in nature.Finding value-added applications of the lignin can reduce the waste of resources and environmental pollution caused by the burning of the lignin such as it does in pulp and paper making process.The three main components (cellulose,hemicelluloses,and lignin) in the plant cell wall constitute a complex cell wall structure through forming covalent bonds and hydrogen bonds,which leads to the fact that the lignin is difficult to be separated efficiently from plant cell wall.To achieve the efficient isolation of the lignin from biomass,it is necessary to clarify the molecular structure and functional groups of the lignin in different lignocellulosic raw materials.Based on the identified structures of the lignin macromolecules,efficient isolation methods can be better selected and developed.This paper reviewed the recent advances in the lignin isolation methods for the structural analysis purpose and the latest advances in the structural analysis of the lignin.The application of liquid-state nuclear magnetic resonance (NMR) techniques in the qualitative and quantitative structural analysis of the lignin was reviewed in detail.In addition,based on the current research progress,trends of future research in this field were proposed.In short,the structural analysis of the lignin will provide theoretical basis for the gene regulation and genetic breeding of tree as well as biorefinery of lignocellulosic biomass.

lignin;isolation and purification;structural analysis;NMR technique

S216.2

A

2096-1359(2017)05-0076-09

2016-11-25

2017-01-09

国家自然科学基金(31500486，31430092)。

文甲龙，男，讲师，研究方向为植物纤维化学及生物炼制。

孙润仓，男，教授。E-mail:rcsun3@bjfu.edu.cn