小麦中麦谷蛋白大聚体的提取优化

张 滨，王金水，陈 迪，秦逸飞，刘效谦

(河南工业大学生物工程学院，河南 郑州 450001)

小麦中麦谷蛋白大聚体的提取优化

张 滨，王金水，陈 迪，秦逸飞，刘效谦

(河南工业大学生物工程学院，河南 郑州 450001)

小麦的蛋白组成及结构是影响小麦粉加工品质的重要因素，其中面筋蛋白中麦谷蛋白大聚体(GMP)是对小麦粉品质贡献最大的组分，但因其组成和结构复杂，对其分离和定量一直是难以彻底解决的问题。以市售小麦粉为原料，研究了利用凝胶色谱法(SE-HPLC)高效提取GMP的控制条件。考察了提取方式、液料比、SDS含量及DTT含量对SE-HPLC法提取GMP的影响，并且基于以上结果，选取液料比、SDS含量及DTT含量等三个因素做响应面分析。响应面分析结果表明，液料比、SDS含量及DTT含量的最佳条件分别为17.72∶1、1.59%、1.69%；且在此条件下，GMP的理论提取率为67.85%。在该优化条件下，验证试验GMP的提取率为65.71%，是初始条件的2.84倍，实现了GMP的高效提取，探索出用于SE-HPLC分离麦谷蛋白大聚体提取和样品制备的方法。

麦谷蛋白大聚体；小麦；提取；凝胶色谱法；响应面分析

麦谷蛋白是小麦面筋的主要成分，以聚合体的形式存在，根据其在SDS缓冲液中的溶解度不同，可分为可溶性麦谷蛋白和不可溶性麦谷蛋白(即麦谷蛋白大聚体，GMP)[1]。可溶性麦谷蛋白的分子量较小，主要影响面团的延伸性；麦谷蛋白大聚体的分子量较大，主要影响面团的弹性和强度[2-3]。目前，我国小麦的蛋白质含量并不低, 而品质较好的品种也多数具有优质亚基, 但实践表明,具有优质亚基品种的面团特性和加工品质并不一定优良, 与国外优质小麦仍有较大差距, 主要表现为面筋强度较弱和延伸性较差, 难以满足优质面包、馒头和面条加工品质的需求, 原因可能是贮藏蛋白组成较差。研究表明, 贮藏蛋白组分的绝对含量及比例是影响小麦加工品质更直接的因素, 尤其是GMP含量。因此，深入研究影响小麦面筋质量的主要因素, 在育种中采用更有效的评价预测方法, 对于进一步提高小麦品质具有重要意义。

由于GMP组成复杂，不易将其与其他组分分离，因此，GMP的高效分离分析方法一直是国内外研究的热点[4]，对其分离和定量一直是难以彻底解决的问题。常用的GMP含量研究方法有4种:多层浓缩胶SDS-PAGE(MS-SDS-PAGE)方法,优点是可以设计不同胶浓度梯度, 借助凝胶扫描系统比较不同浓度胶中谷蛋白聚合体的粒度分布；缺点是制胶耗时, 单个样品费用较高。近年来，高效毛细管电泳(HPCE)技术已成功地用于小麦HMW-GS 的分离、表征与鉴定[5-6]，但由于缺乏合适的缓冲溶液系统，利用HPCE对LMW-GS进行有效分离鉴定尚处于尝试阶段[7]。目前，国内多采用双缩脲比色法, 该方法的优点是操作简单, 所需仪器设备简单, 但准确性较低[8]。凝胶色谱法(SE-HPLC)从分析速度、准确性以及单个样品费用等方面均优于以上三种方法[9-10]。SE-HPLC对小麦麦谷蛋白的组分有着显著的分离效果[11]。目前，运用SE-HPLC分析小麦储藏蛋白在国内外已经日趋成熟，但用于分析GMP尚未见报道[12]。

在本研究中，利用单因素试验，分析了提取方法、液料比、SDS含量以及DTT含量等对GMP提取的影响。同时，基于单因素试验结果，建立GMP提取的三因素三水平响应面试验和响应面分析，以期得到GMP提取的最佳工艺参数水平。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1主要试剂

小麦粉，市售；十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素、超纯水。

1.1.2主要仪器

Pico 17/21微量离心机,ATY224电子分析天平,磁力搅拌水浴锅,pH计,HPLC-1260高效液相系统,低温高速离心机。

1.2 试验方法

1.2.1样品提取液的制备

样品提取液为质量分数1.5%的SDS的磷酸缓冲液(pH6.9)，参考文献[13-14]。

1.2.2样品处理

称取0.5 g小麦粉于50 ml离心管中，加入2.5 ml样品提取液，30℃水浴1 h，13 000 r/min离心10 min后，弃去上清液。

超声波提取法：取沉淀上层蛋白质凝胶,放入另一个 10 ml离心管,加入2.5 ml样品提取液混匀, 进行超声波破碎处理。

DTT提取法：分别加入质量分数1%DTT和8 mol/L尿素后，再次30℃水浴1 h，13 000 r/min离心10 min，上清液即为GMP，取上清液上样[15]。

所得样品上样前均需80℃水浴2 min，并使用0.45 μm水系尼龙膜过滤，样品常温放置小于48 h[16]，不可反复冻融。用于考察各单因素对麦谷蛋白大聚体提取率的影响，得到提取麦谷蛋白大聚体的适宜工艺条件范围。

1.2.3SE-HPLC色谱工作条件

色谱柱为TSK G3000PWXL；流动相为超纯水；流速为0.4 ml/min；柱温为20℃；进样量为20 μl，在波长280 nm处检测。

1.2.4单因素试验设计

利用单因素试验分别考察了提取方式、液料比、SDS含量、DTT含量对麦谷蛋白大聚体提取率的影响。以下各部分蛋白质含量即其峰面积。

谷蛋白大聚体提取率=谷蛋白大聚体含量÷(谷蛋白大聚体含量+SDS可溶性谷蛋白含量)×100%。

(1)

1.2.5响应面试验设计

在单因素试验的基础上，确定Box-Behnken试验设计的自变量，以麦谷蛋白大聚体的提取率为响应值，通过响应曲面分析，对麦谷蛋白大聚体的工艺条件进行了优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1提取方法对麦谷蛋白大聚体提取率的影响

LMW-GS与 HMW-GS相比，表面疏水性更高，因此，高分子量亚基的保留时间短即会先出峰[17]。在提取过程中，不同的提取方法会影响蛋白质的溶解效果。

利用DTT、超声波等两种方法提取小麦粉中麦谷蛋白大聚体，提取率根据公式(1)计算得出，下同。结果如图1所示。

(a)DTT提取方法

(b)超声波提取方法

注：EPP为SDS可溶性麦谷蛋白；UPP为SDS不可溶性麦谷蛋白，即GMP，下同。

图1不同提取方法对麦谷蛋白大聚体提取的影响

由图1可知，提取方法会显著影响麦谷蛋白大聚体的提取率。采用DTT提取麦谷蛋白大聚体的提取率为37.57%，采用超声波提取时的麦谷蛋白大聚体提取率为23.12%，这表明化学提取方法优于物理提取方法。因此，采用DTT提取方法。

2.1.2液料比对麦谷蛋白大聚体提取率的影响

在初始DTT质量分数为1.0%、提取液SDS质量分数为1.5%、30℃水浴提取1 h后，考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)对麦谷蛋白大聚体提取率的影响，结果如图2所示。

由图2可知，液料比对麦谷蛋白大聚体提取率有一定的影响。液料比从5∶1提高至20∶1，麦谷蛋白大聚体提取率不断提高：而随着液料比继续增加，麦谷蛋白大聚体提取率则开始下降。因此，提取麦谷蛋白大聚体的最佳液料比为20∶1。

(a)液料比对麦谷蛋白大聚体提取率的分离图谱

(b)不同液料比对麦谷蛋白大聚体提取率的影响

2.1.3SDS含量对麦谷蛋白大聚体提取率的影响

在初始DTT质量分数为1.0%，液料比20∶1，30℃水浴提取1 h后，考察不同含量的SDS提取液(质量分数1%、1.5%、2%)对麦谷蛋白大聚体提取率的影响，结果如图3所示。

(a)不同含量的SDS提取麦谷蛋白大聚体的分离图谱

(b)不同含量的SDS对麦谷蛋白大聚体提取率的影响

由图3可知，提取液SDS的含量对麦谷蛋白大聚体提取率有一定的影响。当质量分数从1%提高至1.5%，麦谷蛋白大聚体提取率不断提高；而SDS质量分数增加到2%时，麦谷蛋白大聚体提取率有所下降。因此，选取最优提取液中SDS质量分数为1.5%。

2.1.4DTT含量对麦谷蛋白大聚体提取率的影响

在液料比20∶1，提取液SDS质量分数为1.5%，30℃水浴提取1 h后,考察提取液中不同含量的DTT提取液(质量分数0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)对麦谷蛋白大聚体提取率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，提取液DTT的含量对麦谷蛋白大聚体提取率有一定的影响。当质量分数从0.5%提高至1.5%，麦谷蛋白大聚体提取率不断提高；而此后随着DTT含量继续增加，麦谷蛋白大聚体提取率逐渐下降。因此，选取提取液中DTT质量分数为1.5%。

(a)不同含量的DTT提取麦谷蛋白大聚体分离图谱

(b)不同含量的DTT对麦谷蛋白大聚体提取率的影响

2.2 响应面试验

以液料比、SDS含量、DTT含量为3个影响因素，以麦谷蛋白大聚体的提取率为评价指标，采用软件Design-Expert V8.0.6建立三因素三水平响应面分析，见表1。

表1 响应面法因素水平编码表

Box-Behnken试验设计及结果见表2，并对响应面试验结果进行方差分析,见表3。

对试验结果进行多元回归模拟，得到回归方程，即麦谷蛋白大聚体提取率为：提取率=67.30+0.40A+1.15B+4.19C-0.36AB-0.41AC+0.46BC-0.47A2-3.10B2-11.04C2。

由表3可知，回归方程中因变量和自变量之间的线性关系显著(R2=0.993 9)，P=0.000 1<0.01，说明此方程极显著，表明此模型可分析和预测麦谷蛋白大聚体提取工艺参数。模型中的B、C达到极显著水平，由F值可知，影响麦谷蛋白大聚体提取率的主要因素从大到小依次为：DTT含量、SDS含量、液料比，即DTT含量对麦谷蛋白大聚体提取率的影响最大。

表2 响应面试验设计及结果

表3 二次回归模型方差分析

2.3 响应面分析

液料比、SDS含量以及DTT含量对麦谷蛋白大聚体提取率影响的响应面分析，如图5所示。

(a)液料比和SDS含量对提取率的响应面图

(b)液料比和DTT含量对提取率的响应面图

(c)SDS含量和DTT含量对提取率的响应面图

图5反映了液料比、SDS含量以及DTT含量这三个因素对麦谷蛋白大聚体提取率的影响。通过比较可知，DTT含量对麦谷蛋白大聚体提取率的影响较大，曲线变化较陡；SDS含量次之；液料比对麦谷蛋白大聚体提取率的影响最小，曲面变化比较平缓。

2.4 最佳提取条件确定及验证

由Design-Expert V8.0.6分析软件得到的最佳浸提条件为液料比17.72∶1、SDS质量分数1.59%、DTT质量分数1.69%，理论上蛋白质提取率为67.852%。为了检验响应曲面法模型的可靠性，采用上述优化条件进行验证试验，通过3次平行试验，测得蛋白质提取率为65.71%，相对误差为2.142%，没有显著性差异。验证试验结果接近Design-Expert软件预测的结果。

3 结论

通过单因素试验发现，化学提取法提取小麦中的GMP的提取率远高于物理提取法，并通过响应面试验，进一步对化学提取法做了优化，结果显示：在提取时间为60 min，利用DTT法提取小麦粉中麦谷蛋白大聚体优化工艺条件为液料比17∶1、SDS质量分数1.5%,DTT质量分数1.6%，在此工艺条件下麦谷蛋白大聚体提取率为65.71%，为利用超声波提取的2.84倍。经验证，试验结果与预期结果相近。其中提取液DTT含量对麦谷蛋白大聚体的提取率有较显著的影响，提取液SDS含量和液料比则对麦谷蛋白大聚体的提取率有显著影响。

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(责任编辑：赵琳琳)

HigheffectiveextractionofgluteninmacropolymerinwheatflourbySE-HPLC

ZHANG Bin, WANG Jin-shui, CHEN Di, QIN Yi-fei,LIU Xiao-qian

(College of Biotechnology, Henan Universities of Technology, Zhengzhou 450001,China)

The composition and structure of the wheat protein is the important factors influencing the wheat flour processing quality. Glutenin macropolymer (GMP) in gluten is the largest component of wheat flour. Because of its complex composition and structure, its separation and quantitative analysis are difficult to be completely solved. The high effective extraction conditions of GMP by using SE-HPLC were studied. The effect of extraction methods, liquid to materials ratio, and the concentrations of SDS and DTT on the extraction of GMP by SE-HPLC were investigated; and based on the above results, the three factors (liquid to materials ratio, the concentrations of SDS and DTT) were selected for response surface analysis. The results of response surface analysis indicated that the optimized level of liquid to materials ratio and the concentrations of SDS and DTT were 17.72∶1, 1.59% and 1.69%, respectively,and the theoretical extraction rate of GMP was 67.85%. In the verification test, the extraction rate of GMP with the optimization conditions was 65.71%, that was 2.84 times higher than the extraction rate with the original conditions, and the high effective extraction of GMP by SE-HPLC was achieved,indicating the methods of extracting and preparing samples for the separation of wheat gluten by SE-HPLC was feasible.

glutenin macropolymer; wheat; extraction; SE-HPLC; response surface analysis

S521.1；TS201.2+1

：A

：1003-6202(2017)09-0024-06

2017-07-10；

2017-08-30

国家自然科学基金面上项目(31571780)。

张 滨(1993-)，女，硕士研究生，研究方向为微生物学。

王金水(1964-)，男，博士，教授，研究方向为食品生物技术。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.09.008