不同氧浓度下结肠癌细胞缺氧诱导因子-1α表达及糖酵解的差异

周晓黎 廖艳 刘浩 杨林 李轶西 黄洋 胡伟 时昭红

·论著·

不同氧浓度下结肠癌细胞缺氧诱导因子-1α表达及糖酵解的差异

周晓黎 廖艳 刘浩 杨林 李轶西 黄洋 胡伟 时昭红

目的观察不同氧浓度下结肠癌细胞株SW480中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor HIF)-1α、糖酵解限速酶表达的差异及细胞培养上清液中乳酸浓度的变化。方法将传代培养的结肠癌细胞置于不同氧浓度的环境中培养12小时，采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和western-blot法检测HIF-1α mRNA和蛋白表达水平；RT-PCR和western-blot法检测常氧和缺氧状态下结肠癌细胞糖酵解限速酶葡萄糖转运蛋白(glucose transporter 1，GLUT-1)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDH-A)基因的表达。比色法测定结肠癌细胞上清液中的乳酸浓度。结果随着培养环境氧浓度下降，结肠癌细胞中HIF-1α表达逐步增加(P<0.05)，糖酵解限速酶GLUT-1和LDH-A表达逐步增加(P<0.05)，结肠癌细胞培养上清液中乳酸浓度逐步增高(P<0.05)。结论低氧环境可以上调结肠癌细胞中HIF-1α和GLUT-1、LDH-A的表达，以及细胞培养上清液中乳酸浓度。随着氧浓度下降，差异有统计学意义(P<0.05)。低氧环境下HIF-1α上调可促进结肠癌细胞的增殖。

结肠癌细胞； 低氧环境； 缺氧诱导因子-1α

结肠癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率分别位居第3位和第4位[1]，且超过1/3的结肠癌病人最终发展至转移性疾病[2]。随着人口的老龄化、生活环境及生存环境中致癌因素的增加，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势。我们对人结肠癌细胞株SW480在常氧及不同低氧浓度下缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor HIF)-1α和糖酵解限速酶葡萄糖转运蛋白(glucose transporter 1，GLUT-1)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDH-A)的基因表达差异以及细胞培养液中乳酸浓度的变化进行观察，并探讨它们之间的联系。

材料与方法

一、材料

人结肠癌细胞SW480购自中国科学院上海细胞所，HIF-1α、β-actin引物由primer 5.0软件设计，并由英俊公司合成；一抗HIF-1α Antibody(28b)(sc-13515)，LDH-A Antibody(E-9)(sc-137243)，GLUT1 Antibody(A-4)(sc-377228)购自santacruz公司；一抗Mouse beta-actin antibody(KM9001)购自天津三箭；二抗Goat Anti Mouse IgG antibody及 TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；细胞冻存液：含20%的血清(新生小牛血清、胎牛血清来自杭州四季青公司)，含10%DMSO的培养基(GIBICO)。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒购自美国Fermentas公司；PCR 仪购自Applied Biosystems 公司。

二、方法

1.细胞培养及缺氧处理：结肠癌细胞SW480于含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，培养箱设定为5% CO2，37℃。细胞传代贴壁后分别置入不同氧浓度的培养箱中继续培养：1% O2，5% CO2，94% N2；5% O2，5% CO2，90% N2；10% O2，5% CO2，85% N2；19% O2，5% CO2，76% N2。培养时间为12小时。

2.RT-PCR检测各组结肠癌细胞HIF-1α、糖酵解相关基因GLUT-1和LDH-A mRNA的表达：收集细胞(6 孔板，80% 细胞密度)，13 200 rmp离心5 分钟，留取上清液；细胞沉淀中加入1 ml TRIzol，充分混匀，静置5分钟，然后转移至新的离心管中。加三氯甲烷200 μl，充分混匀，静置10分钟，4℃离心，15分钟。取上清液于另一灭过菌的EP管内，加入等体积4℃的异丙醇，混匀后常温放置10分钟后，4℃离心，13 000 rmp，10分钟；弃上清，管底的白色沉淀即为RNA。加入1 ml 75%乙醇，4℃离心，12 000 rmp，5分钟。弃上清，再瞬时离心，吸干管内液体，晾干，再加入适量的去离子水溶解。2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量。RNA热变性：取1 μg提取的RNA加入oligo(dT)及RNase Free H2O轻轻混匀，65℃变性10分钟，后立即置于冰上2分钟。25℃孵育10分钟后42℃孵育60分钟，70℃加热灭活10 分钟。-20℃保存。

引物由primer 5.0软件设计，并由英俊公司合成。HIF1a forward primer：5′-TTT TGG CAG CAA CGA CAC AG-3′，Reverse primer 5′- TGA TTG AGT GCA GGG TCA GC-3′；β-actin forward primer：5′-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3′，Reverse primer 5′-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GGT-3′ ；GLUT1 forward primer 5′-AAGGCCCTGTTGACGATACC-3′，Reverse primer 5′-GCAGCAGCCTGTGTATGCC-3′；LDH-A forward primer 5′-AGCCCGATTCCGTTACCT-3′，Reverse primer 5′ -CACCAGCAACATTCATTCCA-3′。将引物瞬时离心；按照说明书加入去离子水，加盖混匀，配成100μM/L的贮存液；另取一EP管，将上、下游引物稀释为10.0μM/L终浓度的工作液。反应条件：95℃ 10分钟，95℃ 10秒，60℃ 20秒，72℃ 20秒 40个循环。条带量化通过photoshop软件进行测量。

3.Western-blot法检测各组结肠癌细胞HIF-1α、糖酵解相关基因GLUT-1和LDH-A蛋白的表达：用预冷PBS清洗细胞，加入总蛋白提取液，用移液枪头充分吹打，冰上放置10～20分钟后，将匀浆液吸出放到1.5 ml离心管中。9 000 rpm离心10分钟，取适量上清置于新的1.5 ml离心管中。-80℃冻存。采用BCA法测浓度。将提取的蛋白在100℃加热3～5分钟使其充分变性，再用BCA法测定蛋白浓度。按预定顺序加样。蛋白质量(蛋白质混合物)40 μg。电泳电压调至100 V。“三明治”法电极恒流280 mA转移120分钟。电转完毕后，将电转膜置于5%的脱脂奶粉(TBST配制)中封闭，磷酸化指标用5%的BSA(TBST配制)封闭，37℃ 1小时。封闭的膜用TBST漂洗2次。一抗孵育4℃过夜。TBST摇床洗涤5 分钟。加入二抗孵育1小时，TBST摇床洗涤5分钟，将膜风干，贴在玻璃纸上，加底物，做化学发光，得到胶片，通过photoshop软件进行量化测量。

4.比色法测定细胞培养液中乳酸的浓度：严格按照乳酸浓度测定试剂盒步骤操作。收集细胞培养液2 ml，加入酶工作液1 ml，加入显色剂0.2 ml，混匀后于37℃培养箱反应10分钟，加入终止液2 ml，混匀后使用分光光度计测吸光度值。

三、统计学处理

结 果

1.不同氧浓度下4组结肠癌细胞HIF-1α、GLUT-1和LDH-A mRNA的表达：人结肠癌细胞SW480缺氧环境培养12小时后，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A mRNA表达量较常氧环境培养明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。随着缺氧环境中氧浓度下降，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A mRNA表达量逐步增高，氧浓度10%、5%、1%间比较差异有统计学意义(P<0.05)。氧浓度1%组表达最高。见表1。

2.不同氧浓度下4组结肠癌细胞HIF-1α、GLUT-1和LDH-A蛋白的表达：人结肠癌细胞SW480缺氧环境培养12小时后，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A蛋白表达较常氧环境培养明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。随着缺氧环境中氧浓度下降，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A蛋白表达逐步增高，氧浓度10%、5%、1%组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3.不同氧浓度下4组结肠癌细胞上清液中乳酸浓度测定：人结肠癌细胞SW480缺氧环境培养12小时后，细胞培养上清液中乳酸含量较常氧环境培养明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。随着缺氧环境中氧浓度的下降，细胞培养上清液中乳酸含量逐步增高，氧浓度10%、5%、1%间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 不同低氧环境培养下HIF-1α、GLUT-1和LDH-A mRNA的表达

注：与19%氧浓度组比较，aP<0.05；与1%氧浓度组比较，bP<0.05

表2 不同氧浓度环境培养后HIF-1α、GLUT-1和LDH-A蛋白的表达

注：与19%氧浓度组比较，aP<0.05； 与1%氧浓度组相比，bP<0.05

表3 各组细胞上清液乳酸浓度比较(mmol/L)

注：与19%氧浓度组比较，aP<0.05； 与1%氧浓度组比较，bP<0.05

讨 论

缺氧是所有实体肿瘤生长中的共同特征。在缺氧环境下肿瘤细胞通过改变代谢方式，来促进肿瘤细胞的转移，抑制机体抗肿瘤免疫反应。

HIF-1是一种机体适应低氧或缺氧的氧状态下发挥活性的核转录因子，普遍存在于人以及哺乳动物细胞内，由 α 和 β 两个亚基组成，其中HIF-1α是氧浓度依赖调控的，在维持机体适应缺氧中起关键作用。HIF-1β 为持续表达的蛋白[3-4]。HIF-1α 具有一定的转录活性和广泛的靶基因谱，可调节促红细胞生成素、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子Ⅱ等编码基因的表达，引发一系列生物学效应[5-6]。组织细胞代谢正常时，HIF-1α处于失活状态。当处于低氧状态时，HIF-1α转运到核内，使得肿瘤细胞可以在低氧分压环境下通过改变代谢模式和基因表达最大程度地获得供能，促进细胞增殖，从而加速肿瘤生长。随缺氧时间延长，肿瘤细胞的转录和翻译水平呈指数增加[7]，与许多恶性肿瘤的发生、发展、复发、抗凋亡、产生耐药性相关过程相关[8-9]。王远等[10]采用免疫组化法检测78例大肠腺癌、42例大肠腺瘤和20例癌旁正常组织中HIF-1α蛋白的表达，结果发现，大肠腺癌组织中的HIF-1α表达阳性率高于大肠腺瘤和癌旁5 cm正常黏膜组织。平伟等[11]采用免疫组织化学方法分别检测HIF-1α及赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达，结果发现，HIF-1α 和LOX 在NSCLC 肿瘤组织中表达均明显高于癌旁组织，与肿瘤大小、淋巴结转移和肿瘤分期有关，提示 HIF-1α和LOX在NSCLC 的发生发展中发挥重要的调节作用，可共同促进NSCLC 的进展。本研究结果显示，低氧环境下大肠癌细胞中HIF-1α的mRNA和蛋白表达均显著高于常氧环境，且氧浓度越低，HIF-1α的表达量越高。这表明HIF-1α在大肠癌细胞的无氧糖酵解过程中起到至关重要的作用，并参与了大肠癌的发生及结肠癌细胞的侵袭和转移。

在乏氧区域，肿瘤细胞通过胞膜上的葡萄糖转运蛋白将胞外葡萄糖转运入胞内，经糖酵解途径产生丙酮酸的和 ATP，LDH-A作用转化为乳酸[12]。乳酸的生成构成了肿瘤细胞增殖的局部酸性环境，激活蛋白水解酶的级联反应将前基质金属蛋白酶转化为基质金属蛋白酶，促进癌细胞外基质的降解，有利于肿瘤细胞对周围组织的侵袭[13]。段支前等[14]认为，肾癌病人血乳酸脱氢酶值随着肿瘤复发及远处转移逐步升高。

本研究发现，缺氧环境下大肠癌细胞表达GLUT-1、LDH-A mRNA和蛋白的量以及产生乳酸的量均高于常氧环境，且氧浓度越低结果越显著。张永杰等[15]应用Western-blot法检测LDH-A蛋白在慢病毒介导的LDH-A siRNA转染肠型胃癌细胞株SGC7901中表达的变化，结果显示，LDH-A蛋白在SGC7901细胞株中的表达明显上调，肠型胃癌组织中LDH-A蛋白的表达率高于癌旁正常组织。Xu等[16]研究发现，肿瘤转移能力更强的MCF-7 小鼠移植瘤产生更多的乳酸。这表明缺氧促进大肠癌细胞的糖酵解过程，而糖酵解可能与肿瘤的侵袭、转移、血管生成和免疫逃逸等相关。

本研究从体外培养细胞水平上检测结肠癌细胞在缺氧环境中HIF-1α及糖酵解相关基因的表达变化，以及肿瘤微环境中乳酸含量的变化。结果显示，人结肠癌细胞SW480缺氧环境培养12小时后，HIF-1α、GLUT-1和LDH-A的表达水平较常氧环境培养增高。细胞培养上清液中乳酸含量高于常氧状态下的乳酸含量。随着培养环境氧浓度的下降，这种差异越显著。说明缺氧环境促进结肠癌细胞SW480的糖酵解过程，这可能是肿瘤细胞对微环境的适应性表现，从而介导结肠癌发生发展的过程。

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ThedifferenceofexpressionofHIF-1αandglycolysisincoloncancinomacellswithdifferentialoxygenconcentration

ZHOUXiaoli，LIAOYan，LIUHao，etal.

(DepartmentofGastroenterology，Wuhanfirsthospital，Wuhan430022，China)

ObjectiveTo research the effect of differential oxygen concentration on the expression of HIF-1α and glycolysis in colon cancinoma cells.MethodsColon cancinoma cells(SW480)were cultured in either a normal environment or a hypoxia environment.SW480 cells were divided into four groups.After the cells were cultured in a hypoxia environment for 12h，the expression of HIF-1α protein was detected by western-blot，and the expression of glycolysis associated genes(GLUT-1，LDH-A) was detected by RT-PCR and western-blot.Colorimetric method was employed to determine the concentration of lactic in cell supernatant.ResultsWith the decreasing of oxygen concentration，the expression of HIF-1α，GLUT-1 and LDH-A was upregulated(P<0.05).The concentration of lactic obviously increased in cell supernatant(P<0.05).ConclusionHypoxia environment can increased the expression of HIF-1α，GLUT-1and LDH-A.It suggested that HIF-1α is associated with the glycosis.

colon cancinoma； hypoxia； hypoxia inducible factor-1α

2017-07-24)

(本文编辑：杨泽平)

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.09.012

湖北省自然科学基金资助项目(2014CC1040)

430022 武汉市第一医院消化内科(周晓黎、廖艳、刘浩、杨林、李轶西、胡伟、时昭红)，胃肠外科(黄洋)

时昭红，Email：zhaohshi@126.com