湖栖鳍虾虎鱼在发育生物学综合性实验中的应用初探

王中铎+郭昱嵩+刘皓+刘丽+刘楚吾

【摘 要】以湖栖鳍虾虎鱼为实验材料，从受精、正常胚胎发育过程的观察，环境因素对胚胎发育的影响，内分泌干扰物的浓度梯度刺激对胚胎发育的形态学观察及相关基因表达水平的检测等一系列连续实验的设计，可为生物科学专业发育生物学的综合性实验设计提供参考，使学生掌握一系列发育生物学的基本实验技术，增强学生对知识的理解层次，培养学生的科研兴趣。

【关键词】发育生物学；综合性实验；湖栖鳍虾虎鱼

发育生物学的产生是以胚胎学为基础，并融入分子生物学、细胞生物学、遗传学和生物化学等学科的相关知识和技术，从20世纪70年代开始形成一门独立的学科，近年来取得了巨大进展，成为解释生物个体发育的基础学科，也成为生命科学领域最活跃的学科之一。国内外各高等院校纷纷开设发育生物学作为本科生的专业基础课程，并开设实验教学课程以增加学生理解层次及培养学生科学思维和综合素质[1-3]。发育生物学实验内容包括生殖细胞的发生、受精、个体发育的过程、功能基因表达基因调控的机制和原理、发育与环境的关系、凋亡和再生、发育与进化等等；同时吸纳了分子生物学、遗传学、胚胎学等很多领域的研究手段。发育生物学发展速度快、但架构不成熟。相比其他生物学分支学科，发育生物学实验教学还处于刚刚起步阶段，统一的、可广泛接受和采纳的教学体系还没有形成[4]。传统的发育生物学实验教学内容中相当比重来源于胚胎学实验，主要是作为理论教学的补充，以验证性实验为主，而综合性、设计性的实验内容相对比较少，对学生综合素质、创新能力的培养没有得到足够重视[5]。通过综合性的实验，能够充分发挥实验教学作用，使学生从准备实验材料、药品试剂到具体实验操作的整个实验教学过程中都基本能独立完成，掌握发育生物学的基本实验技术，并且能养成和增强学生良好的创新思维习惯，从而提高发现问题、分析问题和解决问题的能力[6]。但是，至目前为止，由于受到专业领域和实验条件的限制，开设发育生物学实验课程的高等院校还是比较少，难以实现和达到发育生物学的实验目标和对理论课的辅助作用。广东海洋大学水产学院自2002年起对海洋生物学专业本科生开设了发育生物学理论课及实验课，并且不断改革进行和完善发育生物学实验教学体系，于2009年开设了以硬骨鱼类（如金鱼、胡子鲶）和两栖类（如虎纹蛙等）为实验材料的适合于水产类的发育生物学综合性实验，取得了较好的教学效果，但由于实验材料的可操控性不强，使得实验开设的成功率和有效率降低[7]。

由于模式生物具有生理特征能够代表生物界的某一大类群、容易获得并易于在实验室内饲养繁殖及容易进行实验操等优点。为了不受限于实验材料，基于模式生物的《发育生物学》实践教学改革势在必行。至今广泛使用的水产鱼类模式主要有源自亚洲其他地区的斑马鱼、日本青鳉鱼，北美洲的三棘刺鱼等。以斑马鱼为例，该淡水鱼类原分布于本鱼分布于孟加拉，印度，巴基斯坦，缅甸，尼泊尔的溪流。上世纪50年代开始被引进美国、德国等实验室进行开发应用。现已成为全世界广泛接受的实验模型之一。综合而言，一方面斑马鱼具有模式生物共有的特点： 1）作为观赏鱼类之一，容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖；2）受精后3天即可发育出膜，7天开口摄食，3个月既可完全成熟，世代短；3）3-5天可以产卵一次，每次可以产多达200颗成熟卵，因此子代多；4）其基因组已经测定，且已经建立许多纯系，因而遗传背景清楚；5）容易进行实验操作，特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。另一方面，斑马鱼具有自身独有特色，有利于回答研究者关注的问题：1）能够很好代表生物界脊椎动物最大的水生硬骨鱼类中的淡水鲤科类群；2）不会像鼠类、灵长类等导致人类的过敏等影响，对人体和环境无害；3）受精卵到出膜早期均透明，容易观察和操作。

为了更好的与本土资源开发和利用研究相结合，本文利用本地红树林海区的广盐性鱼类湖栖鳍虾虎鱼作为潜在的模式生物开发，辅助斑马鱼、青鳉为研究对象进行发育生物学综合性实验教学的改革探索。

湖栖鳍虾虎鱼（Gobiopterus lacustris）是本实验室对广东省雷州半岛主要红树林海区进行鱼类资源调查时发现的中国鳍虾虎鱼属一新纪录。于高桥镇红树林保护区，东海岛红树林海区，雷州市调风镇九龙山红树林国家湿地公园，附城镇北家村，下六镇红莳地村等附近的河流入海口或浅滩中均发现有湖栖鳍虾虎鱼的分布，并经COI基因区段测序分析确认[8]。成鱼鱼体半透明，无色或淡黄色，可以清晰地看见脊椎骨、肋骨、鱼鳔、肠和性腺等腹部的器官。雌鱼性腺中成熟的卵细胞清晰可见，也可看雄鱼成熟性腺呈黄色。上、下颌围有深色花斑，头部分散着许多黑色花斑或斑点。背面上背鳍两侧各有一行斑点从头部直通尾部。腹鳍、腹部和臀鳍两侧均有花斑。腹部向后，沿着髓棘和肋骨均分布有花斑。每一条鳍棘或鳍条上均分布有斑纹。可以通过生殖乳突、牙齿、性腺等形态学指标区分雌雄成鱼个体。

分布于雷州半岛的湖栖鳍虾虎鱼数量多，且半岛两侧均有分布，是这一地区的优势种[9]。由于湖栖鳍虾虎鱼生活在淡水与海水交汇的红树林海区，因此其适应的盐度较广，其个体小易养殖，体色半透明，用肉眼或借助体式显微镜就能观察到体内变化情况，相比较于斑马鱼、青鳉等现有的模式生物，湖栖鳍虾虎鱼成体优势明显，具有开发为模式生物或环境指示物种的潜力。

湖栖鳍虾虎鱼易于人工养殖，已经开发完善了一套较为完备实验室养殖规程。具体如下：养殖水体要经尼龙、生物吸附剂、活性炭、生化过滤器及紫外杀菌系统处理， 溶解氧水平为4-8mg/L，水温为26-30℃。养殖生长期为0.2-0.5L/尾。在实验室培养下成活率高，温度盐度耐受性广。缺点在于截至目前，该鱼尚无法完成實验室的全人工繁育过程，需要在野外采集成熟雌雄个体进行自然产卵。将几种模式鱼类可以进行优势互补，对实验进行多角度分析。

与斑马鱼、青鳉鱼相比，湖栖鳍虾虎鱼的优势在于从鱼卵发育到成鱼不用化学处理均呈现透明状态，非常方便在体式镜下观察发育过程。湖栖鳍虾虎鱼作为实验材料的优势在于胚胎发育历程遵循硬骨鱼类发育的模式，经历受精激活期、胚盘期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期、出膜期这八个阶段，各个时期都有明显的特征，可以完整的跟踪观察胚胎到完全发育为仔鱼的过程。尤其，基于湖栖鳍虾虎鱼的透明成体，可以方便我们进行活体条件下成体性腺、肝脏等内脏器官的形态追踪观察，对科研教学有很好的意义[9]。endprint

针对湖栖鳍虾虎鱼的这些特点，我们设计开展发育生物学观察实验。首先，让学生通过与斑马鱼沉性卵的比较，充分认识湖栖鳍虾虎鱼的粘性卵特点，并思考和讨论不同鱼类受精卵的生态适应和演化机制；其次，通过受精卵不同盐度下的孵化速率和出膜率的比较，认识广盐性鱼类对于盐度的适应性发育能力；再次，比较不同模式鱼类之间出膜时间周期，出膜后鱼体的发育程度和仔鱼的活动能力；第四，充分利用湖栖鳍虾虎鱼成体透明的特点，观察从仔稚鱼到成体转变过程中内部器官的转变过程，以及摄食等不同生活状态下消化系统、血液循环系统的运作；最后，观察性成熟的雌雄个体性腺在不同发育分期下的形态转变，为毒理学实验打基础。

我们还针对湖栖鳍虾虎鱼设计急性和慢性毒理实验。急性实验方面，使用较大浓度的壬基酚等典型的近岸常见污染物处理湖栖鳍虾虎鱼，然后观察形态改变，行为异常并获取半致死浓度等数据。慢性实验方面，使用较低的不同剂量浓度壬基酚等处理湖栖鳍虾虎鱼。考虑到慢性实验周期较长，我们需要设置多个观测时间点，安排在课程的多个阶段，分别开展多方面的实验，具体包括：观察记录外部形态以及肝脏、性腺等内脏状态、测量相应的长度和重量；测定抗氧化气化酶等常规酶变化；qPCR定量ChgL等基因的表达。通过急慢性的毒理学实验，是学生能够全面认识内分泌干扰物的暴露对鱼类个体发育不同阶段的影响，从而充分认识环境保护工作的重要性。

根据发育生物学实验的教学要求，通过以实验室方便人工养殖和操控观察的硬骨鱼类湖栖鳍虾虎鱼为材料，从受精、正常胚胎发育过程（包括内部和外部结构）、环境因素对胚胎发育的影响、内分泌干扰素浓度梯度对胚胎的影响以及检测胚胎发育过程中相关基因的表达水平等，设计一系列连贯实验让学生进行操作，可为发育生物学的综合性实验设计及本科生开放实验项目提供参考。通过以上的实验，使得学生掌握一整套發育生物学的实验技术，增强学生的科研兴趣，培养学生的科研素养，提高学生分析问题和解决问题的能力。

【参考文献】

[1]丁汉波，全允翔，黄浙.发育生物学[M].北京：高等教育出版社，1987.

[2]樊启昶，白书农.发育生物学原理[M].北京：高等教育出版社，2002.

[3]张祥沛，郭炳冉.生物学实验研究[M].2版.青岛：中国海洋大学出版社，2000.

[4]董巍，张媛，许崇任.改革创新发育生物学实验教学的实践与思考[J].高校生物学教学研究，2014，4（1）：46-50.

[5]郭炳冉，鲍淑兰.规范发育生物学实验教学内容的思考[J].实验技术与管理，2008，25（9）：23-24.

[6]李登文，周军.细胞生物学综合性实验的设计[J].实验室研究与探索，2008，27（4）：100-101.

[7]刘皓，刘丽，李锋，郭昱嵩，刘楚吾.海洋生物专业发育生物学综合性实验设计初探——硬骨鱼的人工催青、受精、早期胚胎发育及其调控[J].湛江师范学院学报， 2014，35（5）：1-3.

[8]廖健，张顺，龙水生，等.5种虾虎鱼类线粒体COI基因序列变异及系统进化[J]. 广东海洋大学学报，2016，36（1）：7-12.

[9]廖健，张顺，贺亮，等.基于DNA条形码技术的雷州半岛红树林海区仔稚幼鱼物种多样性研究.第三届环北部湾高校研究生海洋论坛[C].湛江：广东海洋大学， 2015：175-183.

[责任编辑：朱丽娜]endprint