咪唑立宾对肾病综合征大鼠足细胞损伤的影响

陶琳 刘冰

河南省人民医院 肾内科 河南 郑州 450003)

·论著·

咪唑立宾对肾病综合征大鼠足细胞损伤的影响

陶琳 刘冰

河南省人民医院 肾内科 河南 郑州 450003)

目的探讨咪唑立宾(MZR)对肾病综合征大鼠足细胞损伤的影响。方法将36只雄性SD大鼠按照随机数表法分为正常对照组(A组，12只)和模型组(24只)，对模型组大鼠采用尾静脉注射阿霉素(6.5 mg/kg)的方法建立肾病综合征大鼠模型，筛选出建模成功者并按照随机数表法分为B组(肾病模型组)和C组(MZR干预组)，各10只。在注药后8周末采用考马斯亮蓝法检测各组大鼠24 h尿蛋白定量，苏木素-伊红(HE)染色评估肾小球形态结构，通过透射电镜观察肾脏足细胞形态。结果与A、C组相比，B组大鼠24 h尿蛋白定量较高，差异有统计学意义(P<0.05)，且B组大鼠肾脏足细胞损伤程度较A、C两组重，细胞外基质沉淀聚集量较A、C两组多。结论MZR能够减轻肾病综合征大鼠足细胞损伤程度，减少细胞外基质聚集，降低24 h尿蛋白定量，为临床应用MZR治疗肾病综合征提供了依据。【

】 咪唑立宾；肾病综合征；大鼠；足细胞；24 h尿蛋白定量

咪唑立宾(mizoribine，MZR)是一种新型免疫抑制剂，早期多用于预防和抑制肾移植的排斥反应，由于该药能够明显改善患者蛋白尿症状，近年来临床也将其用于儿童和成人难治性肾病综合征等多种免疫相关性疾病的治疗[1]。肾小球足细胞病变造成的肾小球滤过屏障受损，是部分肾病综合征患者出现大量蛋白尿的重要原因[2]。MZR治疗难治性肾病综合征的机制是否与减轻足细胞损伤有关，目前尚缺乏相关研究。本实验应用阿霉素制备肾病综合征大鼠模型，旨在探讨MZR对肾病综合征大鼠足细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物健康清洁级雄性SD大鼠36只(郑州大学实验动物中心提供)，体质量为180～200 g，所有大鼠尿蛋白经检测均为阴性。

1.2主要仪器与试剂注射用阿霉素(上海华联制药有限公司)，灌胃用MZR(日本旭化成制药株式会社)，考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物制品公司)，光学显微镜(上海光学仪器厂)，JOLM100CX-Ⅱ型透射电镜(日本电子公司)。

1.3实验动物模型制备将36只大鼠按照随机数表法分为正常对照组(A组，12只)和模型组(24只)。对模型组大鼠实施单次尾静脉注射阿霉素(6.5 mg/kg)，对对照组大鼠注射等量生理盐水。注射1周后，在代谢笼收集两组大鼠24 h尿量并检测尿蛋白，尿蛋白定量>100 mg/24 h即建模成功。最终共计20只大鼠建模成功，将建模成功的20只大鼠按照随机数表法分为肾病模型组(B组)和MZR干预组(C组)，各10只。给予C组大鼠MZR，20 mg/kg，1次/d，灌胃，连续给药8周；给予A、B两组大鼠等量等时间蒸馏水灌胃。1.4大鼠24h尿蛋白定量检测灌胃结束后，采用代谢笼收集3组大鼠24 h尿液，记录尿量，并采用考马斯亮蓝法测定各组大鼠24 h尿蛋白定量。

1.5肾脏常规病理切片制作收集尿液后处死大鼠，将其肾组织切割成厚度为2 mm的小块，常规石蜡包埋，行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，石蜡切片常规脱蜡至水，Harris苏木素染色5 min，自来水冲洗1 min，1%盐酸酒精分化4 s，水冲洗，饱和碳酸锂显蓝，镜下观察细胞核呈蓝色，伊红染色1 min，脱水、透明、封片，普通光镜观察。

1.6肾脏病理学电镜检查取1 mm3大小的肾皮质浸于2.5%戊二醛，4 ℃冰箱固定4 h，1%锇酸室温固定2 h，梯度酒精-丙酮脱水，超薄切片，铅铀双染。透射电镜下观察肾小球足细胞形态。

2 结果

2.1各组大鼠24h尿蛋白定量变化与B组相比，A、C两组大鼠24 h尿蛋白定量均较低[A组(19.4±4.2)mg，B组(334.2±79.8)mg，C组(150.8±61.2)mg]，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2各组大鼠肾脏HE染色结果A组大鼠肾脏HE染色可见肾小球形态基本正常；B组大鼠肾脏HE染色可见部分肾小球肥大，系膜细胞及系膜基质增生，毛细血管腔中度狭窄，细胞外基质大量聚集；C组大鼠肾脏HE染色可见肾小球系膜区增生较B组轻。见图1。

A：正常对照组；B：肾病综合征组；C：MZR干预组。

图1各组大鼠肾脏光镜表现(HE染色，400×)

2.3各组大鼠肾脏病理电镜表现B组大鼠肾脏病理电镜下可见足细胞出现广泛融合，部分可见足突缺失，C组大鼠足细胞融合少于B组，但较A组足细胞损伤重。见图2。

A：正常对照组；B：肾病综合征组；C：MZR干预组。

图2各组大鼠肾脏病理电镜表现

3 讨论

MZR是一种新型免疫抑制剂。研究发现，由于细胞内外存在浓度差，MZR在进入机体后由细胞外向细胞内移动，进入细胞后在腺苷激酶的作用下磷酸化形成活性物质MZ-5’-单磷酸化物，该物质能够竞争性地抑制中间体肌苷酸脱氢酶和鸟苷酸合成酶，使细胞内鸟苷酸合成减少，从而抑制细胞增殖。由于增殖旺盛的淋巴细胞的鸟苷酸合成主要依赖从头合成途径，而中性粒细胞的鸟苷酸合成却可同时通过从头合成途径和补救合成途径进行，因此，MZR能够特异性地抑制淋巴细胞的增殖，进而抑制抗体的产生[1]。早期临床主要将MZR用于预防和抑制肾移植的排异反应，目前已逐渐将其用于治疗儿童和成人的多种免疫相关性疾病，其在肾病综合征、狼疮性肾炎[3]、紫癜性肾炎[4]、IgA肾病[5]及类风湿关节炎等疾病的治疗中均取得了良好的治疗效果。

足细胞是位于肾小球毛细血管基底膜外侧的脏层上皮细胞，足细胞足突之间的裂孔膜是肾小球滤过的最后一道屏障，足细胞损伤将导致蛋白尿出现。Wang等[6]研究发现，MZR治疗激素依赖、激素抵抗的难治性肾病综合征及特发性膜性肾病，能够减少患者蛋白尿，但MZR治疗难治性肾病综合征的机制是否与减轻足细胞损伤有关，目前尚缺乏相关研究。

多项研究证实，阿霉素肾病大鼠可出现大量蛋白尿，是研究肾病综合征发生机制最好的动物模型之一，其主要病变部位是肾小球足细胞。本研究成功制备阿霉素肾病大鼠模型，并观察到MZR能够降低肾病综合征大鼠24 h尿蛋白水平，同时降低肾脏足突的融合程度，减轻足细胞损伤，降低细胞外基质聚集，提示MZR治疗肾病综合征可能与其对足细胞的保护作用有关，为临床治疗肾病综合征提供了新的依据，但具体作用机制目前尚不清楚，有待于进一步研究。

[1] 黄倩.咪唑立宾在肾脏疾病中的应用[J].国际儿科学杂志,2012,39(3):252-254.

[2] 刘文静,杜玄一.肾脏疾病足细胞保护机制研究进展[J].中国中西医结合肾病杂志,2015,16(12):1112-1114.

[3] Aizawa T,Imaizumi T,Tsuruga K,et al.Mizoribine selectively attenuates monocyte chemoattractant protein-1 production in cultured human glomerular mesangial cell: A possible benefit of its use in the treatment of lupus nephritis[J].Nephrology(Carlton),2014,19(1):47-52.

[4] 李良志,刘雷,何先红,等.咪唑立宾治疗重症过敏性紫癜性肾炎21例疗效观察[J].重庆医学,2010,39(14):1904-1906.

[5] Masutani K,Tsuchimoto A,Yamada T,et al.Comparison of steroid-pulse therapy and combined with mizoribine in IgA nephropathy: a randomized controlled trial[J].Clin Exp Nephrol,2016,20(6):896-903.

[6] Wang X,Song X,Liu Y,et al.Treatment of membranous nephropathy with mizoribine: A control trial[J].Life Sci,2016,154:75-78.

Theeffectofmizoribineonpodocytelesionoftheratswithnephroticsyndrome

Tao Lin, Liu Bing

DepartmentofNephrology,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China)

ObjectiveTo investigate the effect of mizoribine(MZR) on podocyte lesion of the rats with nephrotic syndrome.MethodsThirty-six male SD rats were randomly divided into normal control group (group A, 12 rats) and model group(24 rats). Rat nephrotic syndrome (model group) was established by injecting the adriamycin via the tail veinous injection (6.5 mg/kg), and the successful ones were randomly divided into group B (nephritic syndrome group, 10 rats) and group C (mizoribine intervention group, 10 rats). At the end of the eighth week after injection, the content of the 24-hour urine protein was determined by using coomassie brilliant blue staining, glomerular morphology was investigated by HE dyeing, and the morphology of the podocyte was studied by using transmission electron microscope.ResultsCompared with the group A and C, the 24-hour urine protein of the group B was higher, and the differences were statistically significant (P<0.05). The degree of podocyte lesion of the group B was greater than that of group A and C, and the deposition of extracellular matrix proteins was larger than that of the group A and C.ConclusionMZR can reduce the injury of the podocyte lesion and the deposition of extracellular matrix proteins, decrease the 24-hour urine protein of the rats with nephrotic syndrome, which provides theoretical basis for MZR in nephrotic syndrome.

mizoribine; nephrotic syndrome; rat; podocyte; 24-hour urine protein

河南省医学科技攻关项目(201402028)。

刘冰，E-mail：bingliu6699@126.com。

R 692doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2017.18.001

2017-07-17)