miR-143通过负向调控Bcl-2抑制食管癌细胞的增殖

胡琛琛，张 莉

(湖北省肿瘤医院重症医学科，武汉 430079)

研究报告

miR-143通过负向调控Bcl-2抑制食管癌细胞的增殖

胡琛琛，张 莉*

(湖北省肿瘤医院重症医学科，武汉 430079)

目的探讨miR-143通过负向调控B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抑制食管癌细胞的增殖。方法RT-PCR法检测食管癌细胞TE-1、EC109、EC9706、KYSE150、KYSE510、SEG-1及人正常食管上皮细胞HEEC中miR-143表达，使用脂质体LipofectamineTM2000将miR-143 mimics和miR-143 NC转入EC9706细胞中，48 h后，RT-PCR法检测miR-143表达，CCK-8法检测细胞活力，EdU染色检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期，RT-PCR及Western blot检测Bcl-2蛋白及mRNA的表达。结果miR-143在食管癌细胞TE-1，EC109，EC9706，KYSE150，KYSE510及SEG-1中的表达量[(1.36±0.13)，(1.08±0.10)，(0.89±0.09)，(0.95±0.09)，(1.32±0.14)，(0.96±0.11)]显著低于miR-143在人正常食管上皮细胞HEEC(2.38±0.15)中的表达量(P< 0.01)。与miR-143 NC组比较，miR-143 mimics组miR-143表达量显著升高(P< 0.01)，细胞活力下降(P< 0.01)，细胞增殖能力降低(P< 0.01)，细胞周期阻滞在G1期(P< 0.01)，同时Bcl-2蛋白及mRNA表达量显著降低(P< 0.01)。结论miR-143过表达能通过下调Bcl-2表达抑制EC9706细胞增殖。

miR-143；食管癌；EC9706；增殖；B淋巴细胞瘤-2，Bcl-2

食管癌是消化系统中常见的恶性肿瘤之一，我国每年约有15万人死于食管癌，占了世界病死率将近50%[1, 2]。目前食管癌的主要治疗方式为手术、放疗、化疗相结合，但是患者一旦确诊基本处于中晚期，5年生存率不足20%，因此寻找有效的能够早期诊断、治疗食管癌的生物标志物已成为食管癌等肿瘤领域研究的热点[1, 2]。miRNA是一类高度保守的非编码RNA分子，能与靶基因mRNA的3’非翻译区(untranslated region，UTR)结合，进而降解或者抑制靶基因的转录，从而参与细胞增殖、凋亡、细胞周期等生物学行为的调控[3, 4]。现研究已经显示miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关[5, 6]。同时在食管癌组织及其正常组织中发现多种差异性表达的miRNA，miR-143就是其中的一种，且其在其它肿瘤中的作用机制已被深入探讨，但在食管癌的发生发展的具体作用机制尚未见报道[5-9]。此外肿瘤细胞呈现无限增殖与凋亡抑制，并受凋亡相关蛋白调控，Bcl-2就是其中的一种凋亡抑制蛋白，且有研究显示miR-143能通过下调Bcl-2表达抑制骨肉瘤细胞、宫颈癌细胞增殖[10, 11]，因而本研究推测miR-143是否也可以通过靶向调控Bcl-2进而影响食管癌细胞增殖，本研究将对此推测展开以下实验研究。

1 材料和方法

1.1细胞株

食管癌细胞TE-1、EC109、EC9706、KYSE150、KYSE510及SEG-1购于中国科学院上海细胞库，人正常食管上皮细胞HEEC购于上海酶研生物科技有限公司。

1.2主要试剂和仪器

miR-143 mimics和miR-143 NC购于上海吉玛制药技术有限公司；兔抗Bcl-2单克隆抗体购于美国Epitomics公司；胎牛血清，DMEM培养基购于美国Gibco公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，BCA试剂盒，Trizol法试剂盒，CCK-8试剂盒，细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；LipofectamineTM2000脂质体，一步法RT-PCR试剂盒购自大连宝生生物技术有限公司；EdU细胞增殖试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司。DYCZ-425D型双垂直电泳仪，DYCZ-40D型迷你转印电泳仪购于北京六一仪器厂；GelDoc XR System凝胶成像系统购于美国Bio-Rad公司；FACSCalibur型流式细胞仪，168-1000XC型酶标仪购于美国BD公司；AF6000型荧光显微镜购自德国莱卡公司。1.3实验方法

1.3.1 RT-PCR法检测细胞中miR-143及Bcl-2的表达

采用TRIzol法抽提细胞中总RNA，并检测RNA纯度，通过一步法RT-PCR逆转录RNA，扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳。引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-143上游引物：5’-ACACTCC AGCTGGGTGAGATGAAGCACTGTAG-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；Bcl-2上游引物：5’-CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3’，下游引物：5’-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3’；GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TG GACTCCACGACGTACT-3’。

1.3.2 细胞转染

当EC9706细胞汇合度达到50%～70%左右时候，利用LipofectamineTM2000脂质体转染miR-143 mimics和miR-143 NC，6 h以后换成含10%血清的DMEM培养基；37℃，CO2培养箱培养48 h。应用RT-PCR法检测细胞中的miR-143。

1.3.3 CCK-8法检测EC9706细胞活力

将5×104个细胞接种于96孔板，分别于24 h、48 h、72 h、96 h加入CCK-8试剂，继续培养4 h后，于酶标仪中检测OD值，波长设置为570 nm，所测OD值即细胞活力。

1.3.4 EdU染色检测细胞增殖

将5×104个细胞接种于96孔板，48 h后，消化收集细胞，加入含有EdU的培养基孵育2 h，PBS洗涤后，4%多聚甲醛固定30 min后，按试剂盒说明书要求分别加入试剂B、C、D、E进行孵育，接着PBS洗涤，最后用Hoechst33342染色液室温孵育30 min，后PBS洗涤，并于荧光显微镜下进行观察拍照，最后用Image J进行统计分析。

1.3.5 流式细胞术检测细胞周期

将1×105个细胞接种于6孔板，48 h后，消化收集细胞，接着根据细胞周期检测试剂盒说明书对细胞进行固定，染色并于1 h内在流式细胞仪中进行检测。

1.3.6 Western blot检测细胞中Bcl-2蛋白表达

将1×105个细胞接种于6孔板，48 h后，收集细胞，并加入适量的细胞裂解液，裂解30 min，离心收集上清液，即收获总蛋白。接着采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白经煮沸变性后上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，后湿法转膜30 min。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗溶液(兔Bcl-2单克隆抗体，稀释度为1∶100)4℃过夜孵育，次日室温二抗溶液[辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (H+L)]孵育1～2 h，在凝胶成像系统中曝光，最后采用“Quantity One”软件分析各个抗体条带的灰度值。

1.3.7 荧光素酶报告基因表达分析

miR-143及Bcl-2重组载体共转染到EC9706细胞中。分组如下：(miR-143 mimics) + (pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt)，(miR-143 NC) + (pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut)，(miR-143 mimics) + (pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut)，(miR-143 NC) + (pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut)。应用双荧光素酶检测系统检测转染好的荧光素酶活性，计算公式：相对荧光值=萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值。每个实验组三个平行复孔。

1.4统计学方法

2 结果

2.1miR-143在食管癌及正常食管上皮细胞中的表达

如图1所示，miR-143在食管癌细胞TE-1、EC109、EC9706、KYSE150、KYSE510及SEG-1中的表达量 [(1.36±0.13)，(1.08±0.10)，(0.89±0.09)，(0.95±0.09)，(1.32±0.14)，(0.96±0.11)] 显著低于miR-143在人正常食管上皮细胞HEEC(2.38±0.15)中的表达量，且差异有显著性(P< 0.01)。

注：1.HEEC；2.TE-1；3.EC109；4.EC9706；5.KYSE150；6.KYSE510；7.SEG-1。与HEEC比较，**P< 0.01。图1 miR-143在食管癌细胞及正常食管上皮细胞中的表达Note.1.HEEC; 2.TE-1; 3.EC109; 4.EC9706; 5.KYSE150; 6.KYSE510; 7.SEG-1.Compared with HEEC,**P< 0.01.Fig.1 Expression levels of miR-143 in the esophageal cancer cells and normal esophageal epithelial cells

注：与miR-143 NC组比较，**P< 0.01。图2 miR-143 mimics转染效果的检测Note. Compared with the miR-143 NC group,**P< 0.01.Fig.2 Efficiency of transfection of miR-143 mimics

2.2miR-143mimics转染效果的检测

如图2所示，与miR-143 NC组(0.76±0.07)比较，miR-143 mimics组(1.56±0.15)中miR-143表达量显著上调，差异有显著性(P< 0.01)。

2.3miR-143mimics对EC9706细胞活力的影响

如图3所示，随着转染时间的延长，与miR-143 NC组比较，miR-143 mimics组细胞活力均显著降低，差异有显著性(P< 0.01)。

注：与miR-143 NC组比较，**P< 0.01。图3 miR-143 mimics对EC9706细胞活力的影响Note. Compared with the miR-143 NC group,**P< 0.01.Fig.3 Effect of miR-143 mimics on the viability of EC9706 cells

2.4miR-143mimics对EC9706细胞增殖的影响

如图4所示，与miR-143 NC组(128.58±12.51)比较，miR-143 mimics组(21.74±0.22)细胞增殖数目显著降低，差异有显著性(P< 0.01)。

图4 miR-143 mimics对EC9706细胞增殖的影响(×200)Fig.4 Effect of miR-143 mimics on the proliferation of EC9706 cells

2.5miR-143mimics对EC9706细胞周期的影响

如图5、表1所示，与miR-143 NC组比较，miR-143 mimics组细胞周期阻滞在G1期(P< 0.01)。

2.6报告基因分析

将miR-143 mimics、miR-143 NC及野生型载体pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt、突变型载体pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut转入EC9706细胞中，结果发现，miR-143 mimics与野生型载体pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt共转染组的荧光信号强度明显弱于其它转染组(P< 0.01)。而对于突变型载体pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut来说，各组间荧光强度差异无显著性(P> 0.05)，见图6。

Tab.1Effect of miR-143 mimics on the cell cycle of EC9706 cells

组别GroupsG1期G1phaseS期SphaseG2期G2phasemiR⁃143NC5238±5251674±1723088±172miR⁃143mimics6457±621∗∗1246±125∗∗2297±260∗∗

注：与miR-143 NC组比较，**P< 0.01。

Note. Compared with the miR-143 NC group,**P< 0.01.

注：与pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt比较，**P< 0.01。图6 报告基因分析Note. Compared with pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt,**P< 0.01.Fig.6 Analysis of the reporter genes

2.7miR-143mimics对EC9706细胞中Bcl-2蛋白及mRNA表达的影响

如图7所示，与miR-143 NC组比较，miR-143 mimics组Bcl-2蛋白及mRNA表达量下调(P< 0.01)。

注：与miR-143 NC组比较，**P< 0.01。图7 miR-143 mimics对EC9706细胞中Bcl-2蛋白及mRNA表达量的影响Note. Compared with the miR-143 NC group,** P < 0.01.Fig.7 Effect of miR-143 mimics on the expression of Bcl-2 protein and mRNA in EC9706 cells

3 讨论

1993年Ambros等学者在秀丽隐杆线虫中第一次发现了miRNA，即lin-4，随后又有学者于2000年在秀丽隐杆线虫中发现了第二个miRNA，即let-7。往后的二十几年间学者陆续于脊椎动物、植物及病毒中发现了上千种的miRNA，在这期间有学者于2002年发现了miRNA与肿瘤的关系，在慢性淋巴细胞白血病中存在着miR-15与miR-16的表达量下调或者缺失，并且这两个miRNA还与白血病的发生发展密切相关，引起了研究者深厚的兴趣，并进一步的深入研究miRNA在肿瘤中的作用机制[3, 4]。miRNA在食管癌组织及正常组织中存在着差异性表达，miR-143就是其中的一种。miR-143位于人类染色体5q32，最早被发现于鼠类，具有显著的组织特异性。Wu等[7]利用miRNA微阵列分析方法发现了miR-143在食管癌组织及正常组织中存在差异性表达，进一步用RT-PCR也证实了miR-143在食管鳞状细胞癌患者中的表达量是下调的，且将稳定表达miR-143的质粒转染到食管癌细胞后，发现细胞迁移能力显著的降低。后续Liu等[12]，Ni等[13]也都证实了miR-143在食管癌中的低表达。同时miR-143在其他肿瘤中的具体作用机制已深入报道，在食管癌中的具体作用还尚未可知[8, 9]，因此本研究将对此展开讨论。

本研究首先利用RT-PCR法检测了6株食管癌细胞中(TE-1，EC109，EC9706，KYSE150，KYSE510及SEG-1)及1株人正常食管上皮细胞HEEC中miR-143的表达，结果表明miR-143在组织标本中的表达趋势一致，食管癌细胞中的miR-143表达量也显著低于正常食管细胞。接着利用脂质体转染miR-143 NC和miR-143 mimics，转染效果通过RT-PCR验证，结果也表明转染成功。进一步的利用CCK-8及EdU染色检测miR-143 mimics对EC9706食管癌细胞活力及增强情况的影响，结果表明miR-143 mimics能显著的降低EC9706细胞活力，并抑制细胞增殖能力，与miR-143在结直肠癌细胞中的作用效果一致[8, 9]。说明提高EC9706细胞中miR-143表达量能显著的抑制细胞的增殖能力。另外肿瘤细胞的无限增殖源自于细胞周期的不可控制，细胞周期关键调控点包括G1，S及G2期，且这3个调控点是众多肿瘤药物作用于肿瘤细胞的靶点之一[14, 15]。因此本研究进一步探讨miR-143 mimics对EC9706细胞周期的影响，结果表明miR-143 mimics能显著延长G1期，使细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞的复制与增殖，与miR-143在肝癌细胞中作用效果一致[16]。从而说明miR-143 mimics能通过阻滞EC9706细胞周期于G1期，从而抑制细胞的增殖与活力。

肿瘤细胞的无限增殖与凋亡抑制受到细胞凋亡蛋白的调控作用，其中Bcl-2家族是最常见的细胞凋亡调控家族。Bcl-2是研究最为广泛的凋亡抑制蛋白，是第一个在淋巴细胞中被发现的能抑制细胞凋亡的蛋白，能与促凋亡蛋白Bax形成异二聚体，进而调控细胞的增殖与凋亡。而miRNA对于细胞生物学行为的调控作用，主要是通过对其下游靶基因的调控作用实现的[17]，且已有研究表明miR-143能通过下调Bcl-2表达抑制骨肉瘤细胞、宫颈癌细胞增殖[10, 11]，但是否能够此作用机制抑制食管癌细胞的增殖还尚不可知。所以本研究首先利用荧光素酶报告基因检测了miR-143 mimics对野生型Bcl-2载体及突变型Bcl-2载体荧光信号的影响，结果证实只有野生型Bcl-2载体的信号减弱，说明miR-143 mimics能够结合于Bcl-2的3’ UTR区域，进而抑制其表达。接着利用Western blot及RT-PCR进一步证实了miR-143 mimics能通过下调Bcl-2蛋白及mRNA表达，从而说明miR-143 mimics通过负向调控Bcl-2表达，进而使EC9706细胞周期阻滞于G1期，并抑制细胞增殖与活力。

综上所述，miR-143在TE-1，EC109，EC9706，KYSE150，KYSE510及SEG-1细胞中的表达量显著低于其在HEEC细胞中的表达量，因此上调EC9706细胞中miR-143表达量能显著降低Bcl-2表达，进而抑制细胞活力及增殖能力，并使细胞周期阻滞在G1期。

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InhibitionofproliferationofesophagealcancercellsbymiR-143throughnegativeregulationofBcl-2expression

HU Chen-chen， Zhang Li*

(Department of Intensive Care Medicine, Hubei Cancer Hospital, Wuhan 430079, China)

ObjectiveTo investigate the effect of miR-143 on proliferation of esophageal cancer cells by negative-regulation of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2).MethodsThe expression levels of miR-143 in the esophageal cancer cells TE-1, EC109, EC9706, KYSE150, KYSE510 and SEG-1 and human normal esophageal epithelial cells HEEC were detected by RT-PCR. miR-143 mimics and miR-143 NC were transfected into EC9706 cells by LipofectamineTM2000. After 48 h, the expression levels of miR-143 were detected by RT-PCR, the viability and proliferation of the cells were measured using CCK-8 and EdU staining, the cell cycle was analyzed by flow cytometry, and the expression of Bcl-2 protein and mRNA was detected by Western blot and RT-PCR.ResultsThe expression levels of miR-143 in esophageal cancer cells TE-1, EC109, EC9706, KYSE150, KYSE510 and SEG-1 [(1.36±0.13), (1.08±0.10), (0.89±0.09), (0.95±0.09), (1.32±0.14) and (0.96±0.11)] were significantly lower than that in the human normal esophageal epithelial cells HEEC (2.38±0.15) (P< 0.01). Compared with the miR-143 NC group, the expression level of miR-143 was significantly increased (P< 0.01), the cell viability and proliferation were decreased (P< 0.01), the cell cycle was arrested in the G1 phase (P< 0.01), and the expression of Bcl-2 protein and mRNA was significantly decreased (P< 0.01) in the miR-143 mimics group.ConclusionsOver-expression of miR-143 can inhibit the proliferation of esophageal cancer EC9706 cells through down-regulation of Bcl-2 expression.

miR-143; Esophageal cancer; Cell line EC9706; Proliferation; B-cell lymphoma-2, Bcl-2

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0065-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.012

2016-12-19

胡琛琛(1979-)，女，医学硕士，研究方向：重症医学。E-mail: 1789972061@qq.com

张莉(1978-)，女，副主任医师，医学硕士，研究方向：肿瘤重症。E-mail: koshenshen@sina.com.cn