2012年云南省边境地区蚊虫及蚊传虫媒病毒调查

雷雯雯 郭晓芳 付士红 冯云 杨中华 王环宇 何英 高晓艳 吕志 周红宁 梁国栋

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(雷雯雯、付士红、王环宇、何英、高晓艳、吕志、梁国栋)；665000 普洱，云南省寄生虫病防治所 云南省虫媒传染病防控研究重点实验室(郭晓芳、杨中华、周红宁)；671000 大理，云南省地方病防治所 云南省病毒立克次体研究中心(冯云)

·论著·

2012年云南省边境地区蚊虫及蚊传虫媒病毒调查

雷雯雯 郭晓芳 付士红 冯云 杨中华 王环宇 何英 高晓艳 吕志 周红宁 梁国栋

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(雷雯雯、付士红、王环宇、何英、高晓艳、吕志、梁国栋)；665000 普洱，云南省寄生虫病防治所 云南省虫媒传染病防控研究重点实验室(郭晓芳、杨中华、周红宁)；671000 大理，云南省地方病防治所 云南省病毒立克次体研究中心(冯云)

目的了解云南省南部边境地区蚊虫中虫媒病毒的分布特点，为虫媒病毒病防治提供科学依据。方法2012年7—8月在云南省西双版纳傣族自治州勐海县打洛镇和普洱市江城县整董镇采集蚊虫标本，用组织培养法分离病毒，使用蚊媒病毒种属特异性引物对阳性病毒分离物进行鉴定。结果共采集蚊虫标本6属17种18 714只。三带喙库蚊为当地优势蚊种，占蚊虫采集总数的59.74% (11 179/18 714只)。从采集的蚊虫标本中分离到23株病毒分离物，其中2株坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)、3株乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、2株盖塔病毒(Getah virus, GETV)、4株版纳病毒(Banna virus, BAV)、9株浓核病毒(Densovirus, DNV)和3株套式病毒(Nam Dinh virus, NDiV)。结论云南省边境地区不仅蚊虫种类丰富，而且蚊虫携带多种虫媒病毒。

云南省位于中国西南部，其西部同缅甸接壤，南部同老挝、越南毗连，中老缅边境地区属于热带、亚热带季风气候，全年高温，夏季湿热多雨，有利于蚊媒和其宿主动物的生存、繁殖以及虫媒病毒的存在和传播[1-3]。大量的调查和研究证实，云南省存在多种虫媒病毒病的法定报告传染病，包括登革热(Dengue fever, DEN)、流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)、森林脑炎(Tickborne encephalitis, TBE)等[4]。对该地区进行血清流行病学调查，显示乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、登革热病毒(Dengue fever virus, DFV)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus, SINV)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIV)、巴泰病毒(Batai virus, BATV)等10余种虫媒病毒抗体为阳性[5]。而与云南省直接相邻的东南亚国家均为多种虫媒病毒病的流行区，由于云南省特殊的地理位置，与东南亚国家之间的边贸往来频繁，为虫媒病毒的传入和输出创造了条件。鉴于此，本研究于2012年夏季在云南省南部边境地区采集蚊虫标本，进行虫媒病毒监测研究，以掌握该地区蚊虫种类及蚊传虫媒病毒分布情况，为当地疾病防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1标本采集2012年7—8月，利用光催化诱蚊器和光诱蚊灯在云南省西双版纳傣族自治州勐海县打洛镇城子村、曼掌村和普洱市江城县整董镇麻木树村、曼贺村四个村庄居民区的人房、竹林、牛圈、猪圈中采集蚊虫标本。将蚊虫置于-20 ℃冰箱冷冻至死，在冰排上分类鉴定蚊种，50～100只同属蚊虫装入1支细胞冻存管，登记标号后冻存于液氮中运输至本实验室。

1.2标本处理与病毒分离首先将冻存的蚊虫标本倒入预冷的装有4.5 mm铜珠和1.5 ml研磨液(含50% DMEM、50% 1640、双抗、谷氨酰胺)的无菌离心管中，在组织震荡仪(Qiagen，德国)上4 ℃振荡研磨3 min。随后将蚊虫研磨液4 ℃ 12 000×g离心30 min，上清液接种C6/36和BHK-21细胞，并分别置于28 ℃和37 ℃培养箱培养，每日观察细胞病变(Cytopathic effect, CPE)情况。当CPE达约80%时收获，以-20 ℃反复冻融3次，4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清再次接种两种细胞，连续盲传3代，保留有规律CPE的分离物。

1.3病毒鉴定采用QIAamp Viral RNA提取试剂盒(Qiagen，德国)按照操作说明从细胞培养上清中提取病毒核酸，使用随机引物pd(N)6和Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads试剂盒(GE Healthcare，英国)获得病毒cDNA。分别使用黄病毒属[6]、甲病毒属特异性引物[6]、JEV E基因片段[7]、盖塔病毒(Getah virus，GETV)E2基因片段[8]、浓核病毒(Densovirus, DNV)NS1基因片段[9]、版纳病毒(Banna virus, BAV)第12节段引物[10]、套式病毒(Nam Dinh virus, NDiV)S基因特异性引物[11]进行PCR扩增，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小，回收阳性PCR产物并进行测序分析。

2 结果

2.1蚊虫分布2012年7—8月在云南省西双版纳傣族自治州勐海县打洛镇和普洱市江城县整董镇共采集到6属17种18 714只蚊虫标本(表1)。其中打洛镇采集4属10种11 905只蚊虫，优势蚊种为三带喙库蚊(9 090只)、骚扰阿蚊(1 087只)和白纹伊蚊(1 006只)；整董镇采集6属16种6 809只蚊虫，优势蚊种为三带喙库蚊(2 089只)、圆斑伊蚊(1 140只)和棋斑按蚊(949只)。两地优势蚊种为三带喙库蚊11 179只(59.74%)、白纹伊蚊1 471只(7.86%)。

2.2病毒分离将所有蚊虫标本分为246批进行研磨，分别接种C6/36和BHK-21细胞并连续盲传3代，最终获得23株阳性分离物，其中有7株分离物同时对C6/36和BHK-21细胞致病变，16株分离物只对C6/36细胞致病变。阳性分离物的病变时间和病变特征如表2所示。

表1 云南省2012年采集蚊虫标本的数量及构成比

表2 云南省2012年病毒分离物病变时间和病变特征

注：-表示无细胞病变

Note:- indicates lack of cytopathic effect(CPE)

2.3病毒的分子生物学鉴定分别使用黄病毒属、甲病毒属通用引物、JEV、GETV、DNV、BAV和NDiV特异性引物对23株阳性分离物进行PCR扩增，阳性片段经测序比对，结果发现3株分离物为JEV(YN12050、YN12059、YN12147)，2株分离物为TMUV(YN12115、YN12193)，2株分离物为GETV(YN12031、YN12042)，9株分离物为DNV(YN12035、YN12047、YN12067、YN12072、YN12098、YN12136、YN12186、YN12211、YN12230)，4株分离物为BAV(YN12053、YN12113、YN12234、YN12243)，3株分离物为NDiV(YN12039、YN12040、YN12060)。

3 讨论

资料表明，云南蚊类共有7属230多种[12]。本次研究对云南省南部边境地区开展蚊虫种类及蚊媒病毒调查，采样时间选择在2012年7月至8月的雨季，是蚊虫活动最频繁的时间段，采集到的蚊虫种类更具有普遍性。本次蚊虫调查结果显示，在该2个地区共采集到6属17种18 714只蚊虫标本，包括库蚊、伊蚊、按蚊、领蚊、杵蚊、阿蚊属，提示边境地区蚊虫种类较多。通过分析2个地区的蚊虫数量和种类发现，打洛镇2个采集点的标本数量最多，4属10种蚊虫共11 905只，占整个标本采集数量的63.62%；整董镇2个采集点共采集到6属16种蚊虫6 809只，占整个标本采集数量的36.38%。总体来看，打洛镇采集到的标本数量最多，但种类相对较少；整董镇采集到的标本种类更多，蚊种更为丰富，但数量相对较少。研究结果为当地虫媒生态研究和防控提供了参考。

云南省位于我国西南边境，与云南省直接相邻的东南亚国家均为多种虫媒病毒病的流行区，多种虫媒病毒广泛存在[13]。本次调查在中缅边境的西双版纳傣族自治州勐海县打洛镇和中老边境地区的普洱市江城县整董镇分离到BAV、JEV、TMUV、GETV、DNV和NDiV 4个科5个属的6种病毒共23株，表明边境地区存在多种虫媒病毒。其中在打洛镇分离到BAV、JEV、TMUV、GETV、DNV和NDiV 6种病毒共17株，在整董镇分离到BAV、JEV、TMUV、DNV 4种病毒共6株，提示不同采集点分离的虫媒病毒种类和数量有差异。

虫媒性传染病大多是自然疫源性疾病，分布广，危害大，发病多，云南省近年常发生虫媒病毒病的暴发流行[4]。自20世纪80年代以来，经过大量的调查和研究，已多次从云南省的标本(包括患者、蚊虫、鸟、蝙蝠、蜱、蠓等)中分离到JEV、DFV、森林脑炎病毒(Tickborne encephalitis virus，TBEV)、SINV、CHIV、GETV、BAV、Kadipiro病毒、Toti病毒、BATV、云南环状病毒(Yunnan orbivirus，YUOV)等10多种病毒，本次调查从采集的蚊虫标本中分离到BAV、JEV、TMUV、GETV、DNV和NDiV共6种病毒，其中TMUV首次从云南蚊虫分离，NDiV病毒继深圳发现我国首株全球第二株NDiV后，这是我国发现的全球第三株NDiV。了解云南边境地区虫媒病毒的种类、分布和宿主媒介特点，对当地虫媒病毒病的防治具有现实意义。

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InvestigationofmosquitoesandarbovirusesintheborderareasofYunnanprovince,2012

LeiWenwen,GuoXiaofang,FuShihong,FengYun,YangZhonghua,WangHuanyu,HeYing,GaoXiaoyan,LyuZhi,ZhouHongning,LiangGuodong
StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(LeiWW,FuSH,WangHY,HeY,GaoXY,LyuZ,LiangGD);YunnanProvincialKeyLaboratoryofVector-borneDiseasesControlandResearch,YunnanInstituteofParasiticDiseases,Pu’er665000,China(GuoXF,YangZH,ZhouHN);YunnanInstituteofEndemicDiseaseControlandPrevention,YunnanProvincialCenterofVirusandRickettsiaResearch,Dali671000,China(FengY)

s:ZhouHongning,Email:zhouhn66@163.com;LiangGuodong,Email:gdliang@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the distribution patterns of arboviruses in Yunnan province near the China-Laos-Myanmar border, China, and to provide evidence for prevention and control of arboviruses diseases.MethodsMosquito samples were collected in Daluo county of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture and Zhengdong county of Pu’er city in Yunnan province, 2012. Viruses were isolated from the samples by tissue culture, positive isolates were identified by RT-PCR with arbovirus species-specific primers, for further sequencing and phylogenetic analysis.ResultsA total of 17 species of mosquitoes from 6 genera were collected. A total of 24 strains of viruses were isolated from the mosquito pools and identified as Tembusu virus (TMUV) (2 strains), Japanese encephalitis virus (JEV) (3 strains), Getah virus (GETV) (2 strains), Banna virus (BAV) (4 strains), Densovirus (DNV) (9 strains) and Nam Dinh virus (NDiV) (3 strains).ConclusionsThe China-Laos-Myanmar border of Yunnan province is rich in species of mosquitoes and arboviruses.

Arbovirus; Yunnan province; Investigation

虫媒病毒；云南省；调查

2017-05-19)

(本文编辑：吕新军)

雷雯雯，郭晓芳，付士红对本文同等贡献

周红宁，Email：zhouhn66@163.com；梁国栋，Email：gdliang@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.008

国家自然科学基金(81290342)；传染病预防控制国家重点实验室项目(2014SKLID103)

LeiWenwen,GuoXiaofangandFuShihongcontributedequallytothisarticle.

Fundprograms: National Natural Science Foundation (81290342); Development Grant of State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control (2014SKLID103).