益母草内生真菌次级代谢产物抑菌活性研究

高培元

（兰州理工大学生命科学与工程学院）

益母草内生真菌次级代谢产物抑菌活性研究

高培元

（兰州理工大学生命科学与工程学院）

目的：对益母草内生真菌次级代谢产物进行抑菌活性研究，为后续研究提供基础。方法：PDA培养基进行发酵，发酵液中菌液和菌丝分离，乙酸乙酯萃取；滤纸片法进行抗菌活性筛选。结果：实验对14株益母草内生真菌次级代谢产物进行研究，可知益母草内生真菌发酵产物对各指示菌均有抑菌作用。结论：益母草内生真菌次级代谢产物具有较强的抑菌作用。

益母草；内生真菌；抑菌活性

益母草(Leonurus japonicus Houtt.)为唇形科植物，一年或两年生草本，含有生物碱和黄酮等活性物质，其干燥地上部分为常用中药， 味辛苦、凉、活血、祛淤、调经、消水，治疗妇女月经不调、胎漏难产、胞衣不下、产后血晕、瘀血腹痛、崩中漏下、尿血、泻血、痈肿疮疡。

一、材料与方法

1、材料

菌种 实验室前期保存的益母草内生真菌。

培养基 PDA培养基：蒸馏水，葡萄糖，马铃薯，琼脂；牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏，蛋白胨，琼脂，NaCl。

试剂 75%医用酒精（山东利尔康消毒科技有限公司），青霉素（160万单位哈药集团制药总厂），链霉素（100万单位华北制药股份有限公司），BR Kermel琼脂粉（北京双旋微生物培养基制造厂），乙酸乙酯（工业级），蒸馏水。

仪器 电热恒温培养箱（型号：HH-B11.500BS）(上海跃进医疗器械有限公司)、电子天平（ES-2002H）(长沙湘平科技发展有限公司)，灭菌锅（YS280B）(上海市三申医疗器械有限公司)，冰箱（BCD-217CFA）(澳柯玛股份公司)，超净台，恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司），恒温振荡器（SHZ-82）（国华仪器有限公司），JJ-CJ-ID 型超净工作台（杭州净化设备厂），AB104-N 电子天平(Mettle-Toledo)，旋转蒸发仪（RE52CS）(上海荣生化仪器厂)，循环水式多用真空泵（SHBIIIA）(郑州长城科贸有限公司)、纱布、锥形瓶、漏斗等。

2、实验（设 计）方案

2.1 菌种的复苏

2.1.1 PDA固体培养基的制备

（1）将20个培养皿灭菌后，放入超净台，紫外灭菌；

（2）将马铃薯洗净，削皮后称重100g，切成小丁，并用蒸馏水洗2～3次；

（3）将马铃薯放入锅中，加入蒸馏水没过马铃薯，并用玻璃棒搅拌蒸煮大约30min；

（4）稍微冷却后，用八层纱布过滤，弃滤渣；

（5）将滤液稀释到500m，加入100g葡萄糖，6.5g琼脂并混合均匀；

（6）将混合均匀的液体装入锥形瓶中，用报纸及纱布封口，高压灭菌30min后，取出放入超净台；

（7）待稍微冷却后加入青霉素和链霉素；

（8）倒平板，每个培养皿约20～30mL，水平放好，待其凝固。

2.1.2 菌种的接种

将冷藏菌种放于室温2h，然后在灭菌30min后的超净台上,以无菌操作法接到2.1.1项下制备的平板上,放于28℃恒温培养箱内培养5-7天。

2.2 菌种的发酵

2.2.1 种子罐培养

将平板上长好的菌种于灭菌30min后的超净台上，接到装有300mL PD培养基的锥形瓶中，放入摇床(28℃，120r/min)中进行震荡培养7-15天。

2.3 发酵液的处理

将发酵好的菌液用八层纱布过滤，将液体与菌丝分离，把得到的菌液和菌丝分别用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位的浸膏。将所得浸膏放入烘箱使之完全干燥，待干燥后制成10mg/ml的样品溶液，装入小玻璃瓶中待用。

2.4 粗品及单体化合物的抑菌

2.4.1 益母草内生真菌发酵产物滤纸片制备及处理

用打孔器将滤纸制成直径为6mm的小圆片，121℃高温灭菌30min备用。待测样品发酵液用无菌水稀释为10mg/ml，以备后用。

2.4.2 牛肉膏蛋白胨培养基的制备

（1）将20个培养皿高温灭菌后，放入超净台，紫外灭菌；

（2）于500ml锥形瓶中称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15-20g；

（3）加1000ml蒸馏水使完全溶解；

（4）调节PH 7.5左右，制成培养基溶液，进行高温灭菌；

（5）灭菌结束将锥形瓶置于超净台中，稍作冷却后及时倒平板；

（6）倒平板，每个培养皿约20～30mL，水平放好，待其凝固。

2.4.3 抑菌试验

将大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，地衣芽孢杆菌，肺炎双球菌，绿脓芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃悬摇24h，制备所需菌悬液，再用无菌水稀释成10-1，10-2，10-3，10-4浓度梯度，在牛肉膏蛋白胨培养基上涂布，37℃培养24小时，确定最适生长浓度。在倒好的培养基中加入最适浓度的菌悬液150ml，用涂布棒将菌液涂布均匀，制成含菌平板，然后用滤纸片蘸取10mg/ml的链霉素缓冲液放在平板中央做阳性对照，再将滤纸片蘸取样品贴在平板上，每皿贴一片，每个菌种做两个平行。完成以后，将平板置于37℃恒温培养箱中培养24h，采用求平均值法测定滤纸片的抑菌圈直径大小，并比较它们抑菌效果。

二、结果与分析

2.1 益母草 内生真菌次级代谢产物抑菌实验测定结果

实验结果表明，益母草内生真菌次级代谢产物对5种指示菌均有不同的抑制作用， 其中对大肠杆菌的抑制作用较为明显，占样品总数的70.1%；对地衣芽孢杆菌有抑制作用的占样品总数的55.2%；对大肠杆菌有抑制作用比较少，仅有4种样品，仅占样品总数的28.6%；对肺炎链球菌有抑制作用的占样品总数的42.9%；对金黄色葡萄球菌有抑制作用的占样品总数的35.7%。其中有5个样品，对2种以上指示菌有抑制作用。经由梯度稀释实验得出样品对指示菌抑制作用的最小抑制浓度，通过对5种不同的浓度的指示菌进行抑菌实验比较，可得益母草内生真菌次级代谢产物具有一定的抑菌作用。

表1 益母草内生真菌次级代谢产物抑菌活性测定结果

实验图例

2.2 结论

抑菌实验表明，具有抑菌作用的样品占样品总数的64.3%，其中具有2种及以上抑菌作用的样品占样品总数的35.7%。但由于提取实验样品均为粗品，所以抑菌作用未能完全发掘出来，表明益母草内生真菌次级代谢产物含有较多的抑菌资源，有待进一步探索。另外实验所采取的滤纸片抑菌法效果稍差，未能得出准确的数据。

三、主要参考文献

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