UPLCMS/MS同时测定桂枝茯苓胶囊中6 种三萜酸类成分的含量

马莹 李家春　黄文哲　王振中　萧伟　宋亚玲　张永文

[摘要] 建立超高效液相色谱质谱联用（UPLCMS/MS）同时测定桂枝茯苓胶囊中 6 种三萜酸类成分含量的分析方法。采用 Agilent Porosheell 120 SBC18柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）；流动相为 0.1%甲酸水溶液甲醇，梯度洗脱，流速0.4 mL·min-1，柱温 30 ℃；进样量 5 μL。质谱条件采用电喷雾离子（ESI）源，多重反应监测（MRM）扫描，定量离子对为m/z 527.8→465.5（茯苓酸），m/z 525.6→465.6（去氢茯苓酸），m/z 483.4→337.3（去氢土莫酸），m/z 481.5→419.5（猪苓酸C），m/z 467.4→337.1（去氫齿孔酸），m/z 453.4→337.0（松苓新酸）。结果显示，6 种三萜酸类成分在进样质量浓度范围内呈现良好的线性关系（r>0.996 8），精密度 RSD<6.2%；重复性 RSD<5.9%，平均回收率分别为 97.90%，100.2%，99.60%，101.7%，102.6%，103.0%。该方法准确、快速、重复性好，实现了中药成方制剂中茯苓三萜酸类成分的定量测定，可为桂枝茯苓胶囊的质量控制提供参考方法；并为含茯苓的中药成方制剂中建立含量测定方法提供参考。

[关键词] UPLCMS/MS； 桂枝茯苓胶囊； 三萜酸； 含量测定

Simultaneous determination of six triterpenoid acids from Guizhi Fuling

capsules by UPLCMS/MS

MA Ying1， LI Jiachun2， HUANG Wenzhe2， WANG Zhenzhong2， XIAO Wei2，

SONG Yaling2， ZHANG Yongwen3*

（1. School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

3. Center for Drug Evaluation， China Food and Drug Administration， Beijing 100038， China）

[Abstract] To establish a UPLCMS/MS method for simultaneous determination of six triterpenoid constituents （pachymic acid， dehydropachymic acid， dehydrotumulosic acid， polyporenic acid C， dehydroeburicoic acid and dehydrotra metenolic acid） in Guizhi Fuling capsules （GFC）. Chromatographic analysis was conducted on Agilent Porosheell 120 SBC18 column （4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）， with 0.1% formic acid aqueous solutionmethanol as the mobile phase for gradient elution at a flow rate of 0.4 mL·min-1. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 5 μL. The samples were analyzed by tandem mass spectrometer with negative electrospray ionization （ESI） source， and monitored under a multiple reaction monitoring （MRM） mode， with the quantitative ion pairs m/z 527.8→465.5 （pachymic acid）， m/z 525.6→465.6 （dehydropachymic acid）， m/z 483.4→337.3 （dehydrotumulosic acid）， m/z 481.5→419.5 （polyporenic acid C）， m/z 467.4→337.1 （dehydroeburicoic acid）， m/z 453.4→337.0 （dehydrotra metenolic acid）. Six triterpenoid acids showed good linear relationships within the investigated concentration ranges （r>0.996 8）， with RSDs of precision less than 6.2%， and all RSDs of repeatability less than 5.9%. The average recovery rate was 97.90%， 100.2%， 99.60%， 101.7%， 102.6% and 103.0% respectively. The method was rapid， accurate， repeatable and could be used as a method for quantitative determination of triterpenoid acids in Chinese medicine prescriptions， providing a reference method for the quality control of Guizhi Fuling capsules and providing a reference for the content determination for Chinese medicine prescriptions containing Poria cocos.endprint

[Key words] UPLCMS/MS； Guizhi Fuling capsules； triterpenoid acids； quantitative determination

桂枝茯苓胶囊（Guizhi Fuling capsules，GFC）是我国传统的纯中药制剂，处方源自汉代名医张仲景的《金匮要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍五味中药组成，具有活血化瘀、消癥的功效，用于治疗妇科血瘀症，子宫肌瘤，慢性盆腔炎，卵巢囊肿，原发性痛经等疾病[12]。

目前，GFC质量标准收载于《中国药典》2015年版一部[3]中，其含量测定项下制定了牡丹皮中丹皮酚，白芍中芍药苷，桃仁中苦杏仁苷的含量测定方法及含量限度，对茯苓中的三萜酸类成分未建立含量测定方法。据文献报道[45]，茯苓三萜酸类成分具有抗炎、免疫调节等药理作用，与GFC临床疗效相关，也被认为是其重要的有效成分[67]。由于三萜酸类成分的含量测定难度较高，迄今为止对该类成分的质量控制方面报道较少[89]。为进一步完善GFC的质量控制方法，本研究首次建立UPLCMS/MS同时测定6种三萜酸类成分含量的方法，并运用于GFC制剂的质量控制中。该方法分析速度快，专属性强，灵敏度高，实现了在GFC中茯苓三萜酸类成分的定量测定，为完善GFC的质量控制标准提供了依据。

1 材料

LC30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司），Analyst Software工作站，APL4000+三重四极杆质谱仪（美国AB公司）；Sartorius BSA224SCW电子分析天平（德国赛多利斯公司）；Mettler Toledo XP6电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ250DB数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；MilliQ超纯水仪（美国密理博公司）。

茯苓酸、去氢茯苓酸、去氢土莫酸、去氢齿孔酸、猪苓酸C、松苓新酸对照品，均由本实验室自制，经面积归一化法测定纯度均>98%；银杏内酯B对照品购自中国食品药品检定研究院（批号110863201209，纯度>99.9%）；桂枝茯苓胶囊（GFC）由江苏康缘药业股份有限公司提供，规格：0.31 g×100粒/盒，批号160202，160301，160302，160401，160701，160802，170230；甲醇（德國Merck公司）、甲酸（美国ACS恩科化学公司）为色谱纯，水为实验室自制超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

分别精密称取茯苓酸、去氢茯苓酸、去氢土莫酸、去氢齿孔酸、猪苓酸C、松苓新酸对照品5.059，5.161，4.528，5.470，5.219，5.083 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容，制得质量浓度分别为0.495 8，0.505 8，0.443 7，0.536 1，0.511 7，0.498 1 g·L-1的对照品储备液，吸取各对照品储备液适量，制得各成分质量浓度均为 10 mg·L-1的混合对照品溶液，于 4 ℃保存，备用。

2.2 内标溶液的配制

精密称取 6.432 mg 银杏内酯 B 于 10 mL 量瓶中，用甲醇定容，制得质量浓度为 0.642 6 g·L-1的内标溶液，精密吸取适量，制得质量浓度为 1 mg·L-1的内标溶液，4 ℃ 保存，备用。

2.3 供试品溶液的配制

取 GFC 10 粒，将内容物置研钵中研磨均匀。取细粉约 0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入乙酸乙酯溶液 50 mL，超声处理（功率 250 W，频率50 kHz）1 h，滤过，减压浓缩（40 ℃）至干，用甲醇溶解定容至 25 mL量瓶中，摇匀，静置，过 0.22 μm 微孔滤膜后备用。

2.4 色谱与质谱条件

2.4.1 色谱条件 色谱柱为 Agilent Porosheell 120 SBC18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）甲醇（B），梯度洗脱（0.01～15 min，92% B；15～15.2 min， 92%～100% B； 15.2～20 min， 100%B； 20～20.2 min，100%～92% B； 20.2～25 min，92% B），流速 0.4 mL·min-1，柱温 30 ℃，进样量5 μL。

2.4.2 质谱条件 APL4000+三重四极杆串联质谱仪，离子化方式为电喷雾离子化（ESI），负离子检测模式，采用多反应监测离子扫描（MRM）；主要质谱参数：气帘气（CUR）体积流量 45 L·min-1；喷雾电压（IS）4 500 V；脱溶剂温度（TEM）450 ℃；雾化气（GS1）体积流量 50 L·min-1；加热辅助气（GS2）体积流量 50 L·min-1。各成分的部分质谱分析参数，见表 1，混合对照品及样品 MRM色谱图，见图 1。

2.5 线性关系

分别精密吸取混合对照品溶液适量，加甲醇溶液稀释至不同质量浓度，摇匀，制得系列混合对照品溶液，分别吸取以上混合对照品溶液 500 μL，加 15 μL内标溶液，混匀，按2.4项下条件，测定峰面积，以峰面积与内标峰面积的比值（Y）对分析物质量浓度（X）进行线性回归，绘制标准曲线，回归方程见表2。结果表明，各成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系。

2.6 精密度

精密称取同一批样品（批号170230），按2.3项下制备 6 份供试品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，内标 30 μL，混匀，按2.4项下色谱及质谱条件进行测定，测定各成分的峰面积，并按内标法计算各成分含量，计算日内精密度，RSD<10%，见表3；另取该样品 6 份，连续6 d内分别同法制备成供试品溶液，并按2.4项下色谱及质谱条件进行测定，测定各成分的峰面积，按内标法计算各成分的含量，计算日间精密度， RSD<10%，见表 3，结果表明方法精密度良好。endprint

2.7 稳定性

按2.3项下制备供试品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，内标 30 μL，分别于 0，2，4，6，8，12，24 h按2.4项下色谱及质谱条件进行测定，测定各成分的峰面积，并计算各成分含量的 RSD，结果见表3，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性

精密吸取同1批（批号170230）GFC样品6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，内标 30 μL，按2.4项下色谱及质谱条件进行测定，测定各成分的峰面积，并计算各成分含量的 RSD，结果见表3，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率

精密称取茯苓酸、去氢茯苓酸、去氢土莫酸，猪苓酸 C，去氢齿孔酸、松苓新酸对照品适量，用甲醇配制成 1 mL含有133.5，55.50，43.05，17.30，13.50，16.50 μg的混合对照品溶液。取已知含量的 GFC 9 份，每份约0.15 g，分成3组，分别精密加入混合对照品溶液各 333 μL（低）、667 μL（中）、1 000 μL（高），分别按2.3项下制备供试品溶液后按2.4项下色谱及质谱条件测定含量，计算6种三萜酸类成分的平均回收率，结果茯苓酸、去氢茯苓酸、去氢土莫酸、猪苓酸C、去氢齿孔酸、松苓新酸的平均回收率依次分别为 97.90%，100.2%，99.60%，101.7%，102.6%，103.0%，RSD依次分别为 2.1%，1.9%，2.1%，2.7%，3.6%，1.7%。

2.10 样品测定

取不同批号的样品0.6 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱及质谱条件进行测定，（每批号 2 份，每份进样 2 次），计算每粒 GFC中 6 种茯苓三萜酸类成分的含量，结果见表4。

2.11 箱线图分析

箱线图[10]是一种描述数据分布的统计图，利用它可以直观的来观察变量值的分布情况，箱线图主要表示变量值的中位数，1/4位数，3/4 位数等统计量。在现有的研究基础上，引入了P来评价批次间的差异，P=CA/CB×100%，其中CA为每个批次各个化合物的含量，CB为 7 个批次各个化合物的平均含量。P越接近于100%表明批次间的差异越小，规定批次间的波动在 75%～125%是可以接受的[11]。采用 SPSS 20.0数据处理软件对测定结果进行处理，对7个批次的GFC中6个三萜酸类成分进行分析，见图2。结果表明，茯苓酸、去氢茯苓酸、去氢土莫酸、猪苓酸C、去氢齿孔酸和松苓新酸的P接近 100%，表明批次间差异性小，去氢茯苓酸与去氢齿孔酸分别有一个异常值，但波动在75%～125%，故不影响整体的质量。由此可以得出不同批次 GFC 的质量并无明显差异。

3 讨论

3.1 GFC中含有茯苓，茯苓的主要指标性成分

三萜酸类成分在制剂中的含量相对较低，由于三萜酸类成分的紫外吸收度也较差，用 HPLCUV 检测灵敏度低，且耗时较长，难以建立有效的含量测定方法。经本实验研究，采用UPLCMS/MS测定GFC中的三萜酸类成分，具有选择性好的特点，且具有更高的灵敏度和专属性，同时该方法亦具有较好的适用性，可以实现在中药成方制剂中茯苓三萜酸类成分的含量测定。

3.2 内标化合物

银杏内酯B为二萜类化合物，结构中有 5 个五元环，而所测成分为三萜类成分，结构中有4个环状结构，比较二者所含有的基团及结构特征，发现二者极性相似，且在甲醇中的溶解度也相似，符合內标物的选择原则（物理化学性质相似等原则），故选择银杏内酯B作为内标物。

3.3 色谱条件

UPLC比一般 HPLC具有更高的选择性和分离度，通过不同溶剂系统（乙腈、甲醇）对 6 种三萜酸类成分分离效果影响的实验比较。实验发现甲醇的分离效果及色谱峰峰形较好，同时向流动相中加入甲酸能抑制三萜酸类成分色谱峰的拖尾。因三萜酸类成分含有COOH，显弱酸性，加入适量甲酸可以改善峰形，调节分离度，结果表明甲醇0.1%甲酸溶剂系统为 GFC中茯苓三萜酸类成分分析的适用溶剂系统。

3.4 质谱条件

本实验用 UPLCMS/MS对三萜酸类成分定量，均采用MRM模式。将6种三萜酸及银杏内酯B分别由针泵进样，直接进入ESI 源进行质谱分析，分别在正负离子模式下检测，待测物在负离子模式下更稳定、灵敏度更高；在负离子模式下检测，同时获取母离子、子离子信息，并选择适宜的子离子探索最佳的CE，DP，EP，CXP。与紫外检测器相比，MRM 技术不需要待测物在色谱柱中完全分离，也不需要物质具有紫外吸收也可以得到相关质谱信息与数据，并有效的进行定性定量分析，增加了定量的准确度。

3.5 三萜酸质谱裂解分析

根据质谱裂解规律，茯苓酸[12]的最佳离子对为m/z 527.8→465.5，裂解的子离子m/z 465.5 为分子离子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2产生的[M-H-H2O-CO2]峰。去氢茯苓酸[13]的最佳离子对为m/z 525.6→465.6，裂解的子离子m/z 465.6 为分子离子峰失去1分子 CH3COOH 产生的[M-H-CH3COOH]峰。去氢土莫酸[13]的最佳离子对为m/z 483.4→337.3，裂解的子离子m/z 337.3 为分子离子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2，以及 C24双键麦氏重排后的产物。去氢齿孔酸[13]最佳离子对为m/z 467.4→337.1，裂解的子离子m/z 337.4 为分子离子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2，以及 C24双键断裂后的产物。松苓新酸[13]最佳离子对为m/z 453.4→337.0，裂解的子离子m/z 337.0 为分子离子峰失去2分子 CH4以及 C24双键麦氏重排后的产物。猪苓酸C[13]最佳离子对为m/z 481.5→419.5，裂解的子离子m/z 419.5 为分子离子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2产生的 [M-H-H2O-CO2] 峰。以上的质谱裂解特征，是 UPLCMS/MS定量分析识别检测成分的信号特征，构成采用 UPLCMS/MS检测三萜酸类成分的理论基础。endprint

3.6 供试品制备方法

对制剂样品前处理过程中，以甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯为提取溶剂，采用超声提取与回流提取法，同时考察提取次数以及时间对实验结果的影响。结果表明乙酸乙酯作为提取溶剂时各成分含量最高，95%乙醇次之，甲醇最小，原因可能是三萜酸类成分极性较小，用乙酸乙酯提取，由于相似相溶作用，成分提取的更完全，而甲醇、95%乙醇极性较大，未能完全提取出三萜酸类成分，最终确定供试液最佳提取条件为：乙酸乙酯为提取溶剂，超声提取1次，提取1 h。

3.7 建立含量测定方法

本实验通过对质谱条件和色谱条件的优化，建立了适合的三萜酸类成分含量测定方法。通过对7个批次的 GFC 进行分析测定，结果表明GFC批间质量一致性较好。UPLCMS/MS同時测定GFC中6种三萜酸类成分的测定方法快速、准确，与传统采用HPLCUV测定的方法相比，能同时测定不同类型的三萜酸类成分，而且样品分析时间大大缩短，能从1 h缩短至15 min；该方法具有分离度高，峰形好的特点，对GFC中茯苓三萜酸类成分的含量测定，可为 GFC的质量控制提供参考方法，由于该方法具有一定的适用性，也可为含茯苓的中药成方制剂中建立含量测定方法提供参考。

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[责任编辑 孔晶晶]endprint