拟南芥microRNA通路中新因子的筛选和突变体分析

赵庆喆，梁 超，莫蓓莘

1)深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060；2)深圳大学生命与海洋科学学院，广东省表观遗传重点实验室，广东深圳518060

【生物工程/Bioengineering】

拟南芥microRNA通路中新因子的筛选和突变体分析

赵庆喆1，梁 超2，莫蓓莘1

1)深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060；2)深圳大学生命与海洋科学学院，广东省表观遗传重点实验室，广东深圳518060

小核糖核酸(micro ribonucleic acid, miRNA)是一类长度为20～24 核苷酸(nucleotide, nt)的非编码的核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)，在植物生长发育过程中具有重要作用．为鉴定参与植物miRNA合成、降解和运输等通路的因子，利用拟南芥转基因株系SUC2:amiR-SUL进行正向遗传筛选体系，通过对该株系进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone, EMS)诱变筛选获得SUP-E45突变体．对该突变体进行表型观察、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和全基因组测序实验．结果显示，突变的基因为Ago1(Argonaute1)， 该基因编码的AGO1蛋白是miRNA通路中至关重要的蛋白，成熟的miRNA与AGO1蛋白结合形成miRISC沉默复合体 (miRNA-induced silencing complex, miRISC)从而对靶基因的表达进行负调控．验证了该筛选体系的可行性．通过该筛选体系可筛选出其他参与miRNA合成、影响miRNA 活性或miRNA运输等通路的因子，为后续拟南芥miRNA通路的研究奠定了基础．

分子生物学；转基因株系SUC2:amiR-SUL； 拟南芥；正向遗传筛选；小核糖核酸；AGO1蛋白；EMS诱变；实时荧光定量聚合酶链式反应；全基因组测序

小核糖核酸(micro ribonucleic acid, miRNA)是一类由内源基因编码、长度约20～24核苷酸(nucleotide, nt)的单链小RNA分子，主要参与动植物基因表达的转录或转录后调控[1-2]．植物中miRNA的生物合成过程包括转录、转录后的加工成熟及功能复合体的装配3个步骤．植物miRNA基因首先由非编码的核基因在RNA聚合酶II(RNA polymerase II，Pol II)的作用下转录成具有茎环结构的5′帽子和3′多聚腺苷酸尾巴的初级miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)，pri-miRNA在DICER-LIKE1(DCL1)、SERRATE(SE)和HYPONASTIC LEAVES1(HYL1)等蛋白组成的dicingbody(D-body)复合体的作用下剪切形成miRNA前体(precusor miRNA，pre-miRNA)[3-6]．pre-miRNA很不稳定，在细胞核内直接由D-body复合物剪切成双链互补的miRNA和miRNA*的结构．miRNA和miRNA*双链在HUA ENHANCER1(HEN1)作用下其3′端甲基化，并通过HASTY(HST)蛋白转运出细胞核[7-8]．在细胞质中miRNA和miRNA*首先被含有 AGO1和RNA解旋酶的沉默复合体(RNA induce silencing complex, RISC)募集，其中一条miRNA会成为成熟的miRNA，另一条miRNA*被降解．

成熟的miRNA主要通过两种机制对基因表达进行调控．植物miRNA介导的调控机制可以是对靶基因的信使RNA(messenger RNA, mRNA)进行剪切，比如miR156通过碱基互补配对结合squamosa promoter binding protein-like (SPL3)的3′UTR，使SPL3的mRNA降解[9]；或者阻遏靶基因mRNA翻译的，比如miR172的靶基因apetala2(ap2)在翻译成蛋白质的过程中，miR172与AP2蛋白的mRNA结合抑制其翻译[10]．miRNA对靶基因抑制的机制主要取决于植物miRNA与其靶mRNA序列互补的程度．

miRNA在植物细胞间可以运动．植物的根主要由中柱、基本组织和表皮组成，基本组织包裹着中柱．文献[11-12]报道，在拟南芥根的基本组织的内皮层中转录生成的成熟miR165/miR166能够以非细胞自主性的方式运动到根的中柱细胞，形成一个由内皮层朝向中柱活性递减的梯度，并靶向PHABULOSA (PHB)蛋白的miRNA，从而使PHB蛋白的表达产物形成了相反的浓度梯度．PHB蛋白在中柱的木质部表达并影响木质部的分化．这些生理现象说明miR165/miR166不仅影响了根部木质部的形成，还有后生木质部和原生木质部的分化也有调控功能．同时，miRNA还能够通过运动调节植物体内矿物质的平衡，有报道称miR399作为信号分子能够调节根部对于磷离子的摄入[13]．而miR395和miR398则分别调节SO42-和Cu2+的吸收[14]，miR172通过运动参与光周期对马铃薯块茎形成的诱导过程[15]．这些例子都说明miRNA的运动不仅参与了植物的生长发育的调节，在植物对环境因子的生理应激反应也有一定的作用．

近年研究发现了很多参与miRNA的生物合成、降解、运动和作用机制的重要蛋白质[16]，本研究旨在确定一种有效的鉴定miRNA途径中重要基因的方法．首先通过EMS诱变处理SUC2:amiR-SUL植株筛选得到SUP-E45突变体植株，对其进行一系列研究，发现该突变体是由于AGO1蛋白发生突变所导致的．AGO1蛋白是miRNA沉默复合体中的效应物．虽然本研究筛选到的是已知功能的基因，但该结果恰好说明采用正向遗传筛选体系是可行的．通过这种筛选体系将获得更多的突变体，有助深入研究miRNA通路．

1 材料与方法

1.1实验材料

Col-0背景下的拟南芥(Arabidopsisthaliana)转基因植株SUC2:amiR-SUL由DetlefWeigel教授惠赠，SUP-E45突变体由本实验室筛选获得．

1.2方 法

1.2.1EMS诱变与筛选

将约10000粒SUC2:amiR-SUL种子用质量浓度为3g/L的EMS溶液诱变处理后种植，根据表型观察，筛选出可稳定遗传的叶脉处白化消失或者扩大的植株．

将确定的候选拟南芥突变体与SUC2:amiR-SUL(母本)进行杂交，得到杂交后第1代(F1)种子；F1代植株自交，获得F2代植株．从F2代的植物中挑选与候选突变体表型相一致的植株作为克隆群体，通常需要50～100棵左右的植株．

1.2.2拟南芥基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)的提取

选取上述F2代植株30d苗60株，采用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethyammoniumbromide，CTAB)的方法提取基因组DNA．将提取的基因组脱DNA用RNA酶消化，并用NanoDrop2000c测DNA样品的浓度，选取D(260)/D(A280)比值在1.8～2.0的基因组DNA样品50个，等量混合成100ng/μL浓度的混合基因组样品，由深圳华大基因研究院进行全基因组测序．

1.2.3测序数据的分析及验证

运用生物信息学技术和手段，将测序得到的原始数据进行去除接头、组装和拼接，并与拟南芥背景植株基因组进行比对，利用单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)计算出突变体植株发生点突变的概率．运用dCAPs(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequences)方法设计引物并将PCR产物进行酶切鉴定，从而验证具体的突变位点．

1.2.4植物总RNA的提取

分别提取对照植株和突变体15d大小的小苗约100mg，按照TRIzol(Invitrogen,USA)说明书提取总RNA，提取过程中用到的所有试剂均用超纯水配制，所用器具都没有污染RNA酶．将提取的RNA用DNA酶I(DNaseI) (ThermoScientific) 消化总RNA中的基因组DNA，冻存-80℃备用．

1.2.5利用实时荧光定量PCR方法检测miRNAs及其靶基因的表达量

采用反转录试剂盒(Takara6110A)完成miRNA和RNA的反转录，反转录的体系均为20μL．miRNA利用茎环反转录PCR(stem-loopreversedtranscriptPCR,茎环RT-PCR)的方法反转录，茎环RT-PCR所用到的引物见表1．

实时荧光定量PCR按照TakaraSYBRpremixextaq(RR820A)试剂说明书操作．反应体积10μl，包含5μL的SYBRpremixextaqⅡ(2×)；0.2μL，ROXreferencedye(50×)；2μL，cDNA模板；正向引物，反向引物各0.2μL．PCR反应程序：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；共40个循环．miRNA的表达量以U6为内参，靶基因的表达量以Ubiquitin5为内参，实验用到的引物见表2和表3．

表1 茎环RT-PCR检测成熟miRNA的引物序列Table 1 Stem-loop RT-PCR primers for identification of mature miRNAs

表2 实时荧光定量PCR检测成熟miRNAs的引物序列

表3 荧光定量PCR检测成熟miRNAs靶标的引物序列

2 结果分析

2.1EMS筛选获得SUP-E45突变体及其表型描述

本研究通过EMS诱变获得了一个突变体SUP-E45， 与转基因株系SUC2:amiR-SUL相比，SUP-E45突变体叶脉叶斑明显缩小．此外，SUP-E45还具有其他明显的表型：真叶呈锯齿状，叶柄较长，叶片呈长椭圆形，侧枝多于SUC2:amiR-SUL的侧枝，果荚呈环状生长等多种表型，如图1(a)、(b)和(c)．此外还发现，SUP-E45植株一般第4片真叶就出现远轴面表皮毛，而对照植株SUC2:amiR-SUL却要到第9片真叶才出现远轴面表皮毛，如图1(d)，且SUP-E45植株的茎生叶明显多于SUC2:amiR-SUL植株的茎生叶，如图1(e)．

2.3SUP-E45突变体荧光定量PCR的分析

SUP-E45突变体的表型和一些已知的影响miRNA合成的突变体表型相似，利用茎环RT-PCR的方法分别反转录了SUP-E45突变体和SUC2:amiR-SUL植株在14d和26d时amiR-SUL和峰度较高的内源miRNAs，如miR156、miR165和miR168．结果显示，植株生长到14d(小苗)时，相对SUC2:amiR-SUL，SUP-E45突变体中amiR-SUL和miR166的含量明显上升，miR390的含量明显下降，但miR156、miR164、miR165、miR168和miR319的含量并未改变，如图2(a)．利用实时荧光定量PCR分别检测SUP-E45突变体和SUC2:amiR-SUL植株中靶标基因表达量的变化，结果显示，SUP-E45突变体中miR156的靶标spl3和spl10含量明显下降；miR168的靶标ago1的含量也明显下降；miR165/miR166的靶标phb和phv的含量明显上升；csd2(copper/zincsuperoxidedismutare2)的含量也明显上升；其他检测的靶标都没有变化，如图2(b)．同时，以生长到26d时植株的叶子作为实验材料，进行荧光定量PCR实验．结果显示，miR156的表达量没有显著变化，miR165和miR168的表达量下降，如图2(c)，amiR-SUL的靶标sul的表达量不变，miR165相对应的靶标phv和rev表达量相对升高，但phb的表达量却是下降的，如图2(d)．

以上实验结果显示，突变体SUP-E45植株中的amiR-SUL、内源miRNA及其靶mRNA表达量并没有明显的上升或下降趋势，突变体SUP-E45的表型变化也许并非miRNA的合成途径中基因发生突变引起的，发生突变的基因可能是在其他途径如miRNA活性或者是miRNA运动中发挥功能的基因．

2.4突变位点的检测与鉴定

对SUP-E45突变体进行全基因组测序，通过基因组比对找到突变位点．结果显示，突变基因是ago1， 突变位点为一个碱基鸟嘌呤(G)突变成了腺嘌呤(A)，从而使相对应的甘氨酸变成了色氨酸，如图3(a)和(b)．

*表示P≤0.05； **表示P≤0.01； ***表示P≤0.001图2 SUP-E45突变体中amiR-SUL和内源miRNA及其靶mRNA的相对表达量Fig.2 Relative expression level of the amiR-SUL, endogenous miRNAs and target mRNAs’ in SUP-E45 mutant

图3 全基因组测序的结果Fig.3 Result of whole genome sequencing

利用dCAPSFinder2.0在线设计鉴定突变体的引物(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)， 如图3(b)，对SUC2:amiR-SUL×SUP-E45F2代植株进行基因型鉴定，鉴定结果如图3(c)，结果显示，突变体的PCR产物不能够被内切酶NdeⅠ切开，只有SUC2:amiR-SUL植株的PCR产物能够被内切酶NdeⅠ切开．

AGO1蛋白在miRNA途径的功能是已知的，但AGO1基因突变位点不同又会形成很多不同的突变表型，ago1-25突变体在2002年就已经发现了，Morel[17]等对ago1突变体进行分析鉴定，并对不同点突变的ago1突变体进行了分类：第1类突变体是因为ago1基因发生突变导致转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)途径缺陷，致使植株发育受到严重缺陷，并且不育(突变体ago1-1到突变体ago1-24)； 第2类突变体是ago1基因突变虽然也引起了PTGS途径的缺陷，但植株的表型相对于野生型矮小，且不育(突变体ago1-26)； 第3类突变体是ago1基因突变使得PTGS途径缺陷，但突变体植株是可育的，而且出现多种发育表型(突变体ago1-25，ago1-27)[17]． 本文筛选到的SUP-E45突变体就属于第3类ago1突变体．AGO1蛋白作为一个功能蛋白在PTGS途径中和植物生长发育方面发挥的作用可能是独立的，而且参与到这两个途径中的AGO1蛋白的结构要求也不一样，从而导致了如此多的突变体的不同表型[17]．

3 讨 论

植物中构成miRNA通路，包括在该通路中起作用的蛋白的基本框架已建立起来．随着对miRNA通路研究的深入，不断发现有其他蛋白参与miRNA通路的相关报道．如Zhang等[18]发现DNA结合蛋白CDC5(celldivisioncycle5)可以与MIR基因的启动子区域相互作用，帮助PolII对MIR基因进行转录，CDC5的缺失会导致PolII在MIR基因启动子区域的结合减弱，从而降低MIR基因启动子的活性；MOS2(modifierofSNC1)蛋白可以结合pri-miRNA和pre-miRNA，并辅助DCL1进行加工[19]等．miRNA通路包括miRNA的合成、降解、运动和发挥功能等途径，为进一步了解miRNA通路的分子机制，研究人员希望通过该正向遗传筛选的方法发现新的参与miRNA通路中的因子，以补充和完善目前已有的miRNA通路的框架．

本研究获得了SUP-E45的突变体，通过全基因组测序发现该突变体是编码AGO1蛋白的基因发生了突变，与ago1-25突变体的突变位点一样．在拟南芥中AGO蛋白家族有10个成员，这些AGO蛋白都含有3个重要的结构域：PAZ、MID和PIWI．最保守的PAZ结构域能结合miRNA并使RISC能够准确定位到靶mRNA，MID-PIWI形成一个结合“口袋”，锚定在单链小核糖核酸 (smallRNA,sRNA)的5′磷酸基上，PIWI结构域具有RNA内切核酸酶的活性[20]．正是AGO蛋白这些重要的结构域，从而决定了其在形成的复合物RISC中的重要作用，也是miRNA的重要因子．

目前，利用SUC2:amiR-SUL正向遗传筛选体系不仅获得了ago1突变体，还获得了miRNA通路中其他一些已知的突变体，如dcl1和hyl1等，这些结果证明了该体系的可行性．另外，本研究还获得了一些具有预期表型的突变体，这些突变体中发生突变的基因在miRNA途径中的功能尚未见报道，我们将进一步研究这些基因与miRNA途径的关系．ago1突变体等已知突变体的获得证明了该系统的可行性，利用该系统将筛选和鉴定更多参与miRNA通路的新因子，阐明miRNA通路的分子机制．

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【中文责编：晨兮；英文责编：艾琳】

IdentificationofnovelcomponentsofArabidopsismiRNApathwayandmutantanalysis

ZhaoQingzhe1,LiangChao2,andMoBeixin1

1)CollegeofLifeSciencesandOceanography,ShenzhenUniversity,ShenzhenKeyLaboratoryofMicrobiologyandGeneEngineering,Shenzhen518060,GuangdongProvince,P.R.China2)CollegeofLifeSciencesandOceanography,ShenzhenUniversity,GuangdongProvincialKeyLaboratoryforPlantEpigenetics,Shenzhen518060,GuangdongProvince,P.R.China

Micro ribonucleic acids (miRNAs) are20-24nucleotides non-coding RNAs that play key regulatory roles in developmental and physiological processes in plants. In order to screen the new components that are involved in miRNA biogenesis, turnover and movement, we establish a forward genetic screening system usingArabidopsisthalianatransgenic line (SUC2:amiR-SUL). After ethylmethylsulfone (EMS) mutagenesis onSUC2:amiR-SUL, one stable mutant line (SUP-E45) is isolated. The result of phenotype observation, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and whole genome sequencing on theSUP-E45mutant plants indicates that the altered phenotype is caused by the mutation inArgonaute1(Ago1) gene. AGO1protein encoded byago1gene is crucial in the miRNA pathways, which recruits mature miRNA to form miRISC silence complex (miRNAs-induced silencing complex, miRISC) to negatively regulate the expression of target genes. The screening system can be used to select other factors that participate in the processing such as miRNA synthesis, miRNA’s activity or miRNA transport. The research can lay the foundation on the subsequentArabidopsismiRNA pathway.

molecular biology;SUC2:amiR-SUL;Arabidopsisthaliana; forward genetic screening system; microRNA (miRNA); AGO1protein; EMS mutagenesis; quantitative real-time PCR(qRT-PCR); whole genome sequencing

2017-02-16；Revised：2017-05-25；Accepted：2017-06-07

Professor Mo Beixin．E-mail: bmo@szu.edu.cn

Q 946.2

：Adoi：10.3724/SP.J.1249.2017.05464

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31571332)

：Zhao Qingzhe, Liang Chao, Mo Beixin. Identification of novel components ofArabidopsismiRNA pathway and mutant analysis[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(5): 464-470.(in Chinese)

国家自然科学基金资助项目(31571332)

赵庆喆(1990—)，女，深圳大学硕士研究生．研究方向：植物表观遗传．E-mail：491325646@qq.com

引文：赵庆喆，梁 超，莫蓓莘. 拟南芥microRNA通路中新因子的筛选和突变体分析[J]. 深圳大学学报理工版，2017，34(5)：464-470.