含量测定结合HPLC指纹图谱用于香加皮质量评价

2017-09-22李瑞雪吴飞张继全

中国医药导报 2017年22期

李瑞雪　吴飞　张继全

[摘要] 目的建立总皂苷含量测定方法和HPLC指纹图谱分析方法，对不同产地香加皮药材进行质量评价。方法采用紫外可见分光光度法，以杠柳苷C（PSA）为对照品，建立香加皮药材中总皂苷的含量测定方法；同时建立香加皮药材HPLC指纹图谱。对12批不同产地的香加皮中总皂苷进行含量测定，建立指纹图谱，计算相似度，采用SPSS软件对两类数据进行聚类分析。结果以5%香草醛-冰醋酸显色体系，检测波长为480 nm，12批药材中总皂苷含量在170～250 mg/g之间，差异较大；采用Capcell Pak C18色谱柱，流动相乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脱，检测波长263 nm，香加皮药材指纹图谱共标定25个共有峰，除1批样品外，其余样品相似度均在0.9以上。对皂苷含量及相似度数据进行聚类分析，结果显示，12批香加皮主要分为两类，高含量组和低含量组。结论建立的含量测定结合指纹图谱分析方法可以更好地用于香加皮的质量评价。

[关键词] 香加皮；紫外分光光度法；HPLC指纹图谱；质量评价

[中图分类号] R961 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（a）-0033-05

[Abstract] Objective To set up a simple and accurate method for the determination and evaluatation of Cortex Periplocae by UV-visible sepctrophotomery and HPLC fingerprint. Methods Determine the contents of 12 batches of Cortex Periplocae with periploside C （PSA） as the reference substance by UV-visible sepctrophotomery， meanwhile establish HPLC fingerprint and calculate the similarity. All data was analyzed by the SPSS statistical software. Results Determine the contents of 12 batches of Cortex Periplocae by 5% vanillin-glacial acetic acid with the detection wavelength at 480 nm. There was a significant difference in contents that ranged from 170 to 250 mg/g. HPLC analysis was performed on a Capcell Pak C18 column with the detection wavelength at 263 nm. The mobile phase was water containing 0.2% formic acid and acetonitrile in the gradient mode. 25 pesks were selected as the common peaks and the similarities were above 0.9 besides batch 7. Based on the results of quantification and fingerprint analysis， the results indicated that the 12 batches cortex periplocae divided into 2 classes： high and low content. Conclusion The established HPLC fingerprint and quantitative analysis methods can be used efficiently in the quality control of Cortex Periplocae.

[Key words] Cortex Periplocae； UV sepctrophotomery； HPLC fingerprint； Quality assessment

香加皮（Cortex Periplocae）為萝摩科植物杠柳（Periploca sepium Bunge）的根皮，又被称为北五加皮、杠柳皮或者香五加皮。最早载于《神农本草经》[1]，《中国药典》也均有收载，其功能祛风湿、强筋骨，用于心悸气短、下肢水肿、风寒湿痹、腰膝酸软[2]。

市场上香加皮与南五加皮混用情况比较严重，给临床用药带来困扰[3-4]。《中国药典》2015年版中以4-甲氧基水杨醛作为药材的含量控制指标[5]，也不能满足当前以C21甾体苷类成分为目标[6-8]的一些新药开发研究需求。分别采用紫外分光光度法[9-14]和指纹图谱方法[15-21]用于评价药材的技术应用甚广，而指纹图谱结合定量分析[22-25]更能综合评价药材质量。本研究建立紫外分光光度法测定总皂苷含量结合高效液相色谱指纹图谱分析方法用于评价不同产地香加皮药材的质量，为香加皮药材的规范种植和新药开发提供技术手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-1800型紫外分光光度计（岛津仪器有限公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Capcell pak C18色谱柱[4.6 mm×250 mm，5 μm，资生堂（中国）投资有限公司]；TE-214S型分析天平（0.1 mg，赛多利斯科学仪器有限公司），XP-205型分析天平（0.01 mg，梅特勒托利多仪器有限公司），SK5200H超声清洗仪（上海科导超声仪器有限公司），KA-1000型离心机（上海安亭科学仪器厂），HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），Milli-Q型超纯水制备仪（密理博中国有限公司）。endprint

中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版，药典委员会），SPSS软件（22.0版）。

1.2 试剂

杠柳苷C（PSA）、杠柳苷K（PSK）、杠柳苷R（WJ53）、杠柳苷E（WJ521）、杠柳苷D（PSD）、杠柳苷Q（WJ33）、杠柳苷（WJ32）对照品（批号均为20160316，由中国科学院上海药物研究所提供，纯度分别为98.16%、98.49%、98.09%、99.04%、98.13%、98.77%、95.86%）；香草醛（批号：20150611，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙醇、甲酸、冰醋酸、高氯酸（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司），蒸馏水（自制）。

1.3 药材

12批香加皮药材饮片购于饮片公司，经中国科学院上海药物研究所赵维民研究员鉴定，12批药材均为萝摩科植物杠柳的干燥根皮。药材详细信息见表1。

2 方法与结果

2.1 紫外分光光度法测定总皂苷

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取PSA对照品适量于25 mL量瓶中，加甲醇溶解制得浓度为1.0256 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备取香加皮药材最细粉1.0 g，加入75%乙醇25 mL，超声30 min（53 kHz），将提取液离心（5000 r/min，10 min）取上清作为供试品溶液。

2.1.3 测定方法精密移取供试品溶液于具塞试管中，挥干溶剂，精密加入0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.6 mL高氯酸，摇匀，密塞，90℃水浴保温50 min，冰水浴10 min，加冰醋酸至10 mL，摇匀，以空白试剂为对照，480 nm下测定吸光度。

2.1.4 方法学考察以PSA含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=4.73267X+0.1156，r=0.9995，表明PSA在0.05128～0.41024 mg范围内呈良好的线性关系。精密度试验中，吸光度RSD为0.022%，表明仪器精密度良好。重复性试验中，药材总皂苷的平均含量为148.73 mg/g，RSD=2.5%，表明方法重复性良好。稳定性试验中，120 min内RSD=1.2%，说明对照品溶液在显色后2 h内基本稳定。加样回收率试验中，平均回收率为99.22%，RSD=1.7%，回收率合格。

2.1.5 样品含量测定取12批药材按“2.1.2”制备供试品溶液，按“2.1.3”方法测定总皂苷含量，结果见表2。试验结果表明，不同产地的香加皮中山西、甘肃和河南的香加皮总皂苷含量几乎都是>200 mg/g，而四川、河北、安徽的香加皮总皂苷含量都不足200 mg/g。

2.2 HPLC指纹图谱研究

2.2.1 液相条件色谱柱：Capcell pak C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脱（0～45 min：10%A→33%A；45～45.01 min：33%A→56%A；45.01～55 min：56%A→80%A；55～65 min：80%A→92%A；65～70 min：92%A→100%A；70～72 min：100%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：263 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备分别精密称取PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA对照品适量于25 mL量瓶中，加甲醇超声（53 kHz）溶解并定容，摇匀，制得对照品单标溶液。各取1 mL于10 mL容量瓶，加甲醇定容，摇匀，得对照品混标溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备取香加皮药材最细粉2 g，加入75%乙醇25 mL，超声（53 kHz）1 h，将提取液离心（5000 r/min，10 min）取上清作为供试品溶液。

2.2.4 方法学考察供试品溶液按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，各色谱峰相对保留时间的RSD均<0.1%；各色谱峰相对峰面积的RSD均在3%之内，表明仪器的精密度较好。6份样品中各色谱峰相对保留时间的RSD均<0.4%；相对峰面积的RSD均在2.9%之内，表明重复性较好。供试品24 h内各色谱峰相对保留时间的RSD均<0.5%；相对峰面积的RSD均在2.9%之内，表明供试品溶液的稳定性良好。

2.2.5 不同产地香加皮HPLC指紋图谱采集和共有峰的标定取12批药材制备供试品溶液并测定，记录HPLC色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对香加皮指纹图谱进行数据处理，确定共有峰25个，建立药材标准指纹图谱和标准指纹图谱，见图1～2。

2.2.6 共有峰的指认取对照品混标溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件，得出对照品的保留时间分别与色谱图上的峰19、峰20、峰21、峰22、峰23、峰24、峰25保留时间一致，由此初步确定峰19为PSK，峰20为WJ53，峰21为WJ521，峰22为PSD，峰23为WJ33，峰24为WJ32，峰25为PSA。

2.2.7 相加皮药材相似度评价采用指纹图谱相似度软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》计算。香加皮药材HPLC指纹图谱相似度计算结果见表3。12批香加皮除S7以外，相似度均在0.9以上，说明从指纹图谱角度看，不同产地的香加皮药材质量有差异也有共性。

2.3 指纹图谱结合总皂苷含量的系统聚类分析

以12批药材中总皂苷含量中最大值作为基准对12批药材中总皂苷含量进行归一化处理，采用SPSS 22.0统计软件进行系统聚类分析，得到聚类树状图3。结果显示，除第7批相似度较低外，其余11批香加皮样品被分为两类，主要为高含量组和低含量组。高含量组包括产地为河南、山西、甘肃的香加皮药材，低含量组包括山西、甘肃、河北、四川、安徽的香加皮药材，而山西和甘肃的香加皮药材含量不一。表明基于总皂苷含量及相似度的综合评价可用于香加皮药材的质量评价及比较。endprint

3 讨论

紫外测总皂苷实验前期对显色剂种类、比例、用量和显色反应温度、时间分别进行了考察比较，确定了最佳显色条件。并对供试品制备中提取溶剂、溶剂体积和提取时间进行考察，确定最佳提取条件。

指纹图谱实验前期分别比较不同溶剂对相加皮药材的提取效果，结果75%乙醇的供试品峰数目较多且峰形较好，含量较均匀；考察了超声、回流两种提取方式，其中超声提取色谱信息更完整；考察了多种流动相系统，结果乙腈-0.2%甲酸流动相系统，基线最为平稳，峰形较好。

紫外测总皂苷含量结合HPLC指纹图谱分析评价法可在一定程度上表征不同產地来源不同批次的药材在皂苷含量方面的差异，基于两者的综合信息，可以为香加皮的产地选择、临床应用及质量快速评价提供参考。在此基础上，若能将药效、毒性与物质基础结合起来，深入开展研究，则更有利于阐明中药作用制剂，完善香加皮的质量评价体系，为用药安全提供进一步保障。

[参考文献]

[1] 神农本草经：卷一上经[M].哈尔滨：哈尔滨出版社，1999.

[2] 张辉云，贺清华，童珊珊，等.香加皮活性成分及其药理作用研究进展[J].药学进展，2013，37（9）：449-453.

[3] 顾蘅，张毅.香加皮的鉴别方法及其临床毒性研究[J].内蒙古中医药，2015，34（4）：110-111.

[4] 林世和，吴建国，余南才.五加皮和香加皮的鉴别[J].光明中医，2010，25（12）：2330-2332.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：257-258.

[6] Zhu YN，Zhao WM，Yang YF，et al. Periplocoside E，an effective compound from Periploca sepium Bge，inhibited T cell activation in vitro and in vivo [J]. J Pharmacol Exp Ther，2006，316（2）：662-669.

[7] Zhang J，Ni J，Chen Z，et al. Periplocoside A prevents experimental autoimmune encephalomyelitis by suppressing IL-17 production and inhibits differentiation of Th17 cells [J]. Acta Pharmacologica Sinica，2009，30（8）：1144-1152.

[8] Wang LY，Chen ZH，Zhou Y，et al. Structural revision of periplocosides and periperoxides，natural immunosuppressive agents from the genus Periploca [J]. Phytochemistry，2011，72（17）：2230-2236.

[9] 黄敏珠，王栋，尹忠臣，等.紫外分光光度法测绞股蓝片中绞股蓝总苷的含量[J].中国中药杂志，2010，35（18）：2410-2411.

[10] 郑湘娟，余淑娴，徐晓芳，等.紫外分光光度法测定虎杖中自藜芦醇的含量[J].时珍国医国药，2008，19（8）：1881-1882.

[11] 潘正，高运玲，蔡应繁.紫外分光光度法测定唐松草中皂苷的含量[J].时珍国医国药，2007，18（1）：40.

[12] 秦雪莲，徐勤，邓立东.紫外分光光度法测定加替沙星片的含量[J].西北药学杂志，2004，19（4）：154-155.

[13] 丛媛媛，帕丽达·阿不力孜，赵文惠，等.紫外分光光度法测定紫花苜蓿黄酮的含量[J].时珍国医国药，2006， 17（3）：363.

[14] 解生旭，徐暾海，韩冬，等.紫外可见分光光度法测定蒺藜果中呋甾总皂苷含量[J].长春中医药大学学报，2008， 24（5）：495-496.

[15] 芮雯，冯毅凡，石忠峰，等.不同产地黄芪药材的UPLC/Q-TOF-MS指纹图谱研究[J].药物分析杂志，2012，32（4）：607-611.

[16] 崔洋，王巧，张兰桐，等.河北道地药材连翘的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中草药，2010，41（2）：297-301.

[17] 曹建军，梁宗锁，杨东风，等.地黄HPLC-DAD多波长指纹图谱的建立及其在熟地黄炮制中的应用[J].中草药，2014，45（2）：265-270.

[18] 方玲，陈方亮，余翠琴，等.不同产地乌药的HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2013，44（2）：229-231.

[19] 吕海鹏，钟秋生，施江，等.普洱茶挥发性成分指纹图谱研究[J].茶叶科学，2014，34（1）：71-78.

[20] 蒋莉娟，皮胜玲，方铁铮，等.香附药材HPLC指纹图谱研究[J].中国当代医药，2016，23（1）：4-7.