一氧化氮合成酶对豚鼠形觉剥夺性近视抑制作用研究

张文龙+许晨+陈俊

[摘要] 目的 观察一氧化氮对豚鼠形觉剥夺性（FDM）近视的影响，探讨一氧化氮对近视视网膜的调控作用。 方法 以豚鼠作为实验材料，建立FDM模型，分为A组（无FDM处理）、B组（FDM诱导10 d）、C组（FDM诱导20 d）、D组（FDM诱导10 d+NOS抑制剂注射）、E组（FDM诱导20 d+NOS抑制剂注射）、F组（FDM诱导10 d+褪黑素注射）和G组（FDM诱导20 d+褪黑素注射），每组各15只。检测各组的屈光度、眼轴长度和视网膜组织中诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）表达水平。 结果 与A组相比，随着FDM诱导时间的延长，近视程度明显加深，眼轴明显延长，同时iNOS水平上升，差异有统计学意义（P < 0.05）。与FDM诱导相比，使用NOS抑制剂处理可以降低近视程度，抑制眼轴增长，降低iNOS的水平（P < 0.05）。 结论 FDM豚鼠视网膜iNOS表达水平上升，而NOS抑制剂处理能够有效抑制近视的发生。因此抑制一氧化氮的合成降低了豚鼠形觉剥夺性近视发生。

[关键词] 形觉剥夺性近视；诱导型一氧化氮合成酶；NOS抑制剂；豚鼠

[中图分类号] R77 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（b）-0022-04

[Abstract] Objective To observe the effect of nitric oxide on formation of deprivation myopia （FDM） in guinea pig， in order to investigate the regulation of nitric oxide on retinopathy of myopia. Methods Guinea pigs were used to establish the FDM model. They were divided into group A （FDM-untreated）， group B （FDM induced 10-day）， group C （FDM induced 20-day）， group D （FDM induced 10-day plus NOS inhibitor injected）， group E （FDM induced 20-day plus NOS inhibitor injected）， group F （FDM induced 10-day plus melatonin injected）， group G （FDM induced 20-day plus melatonin injected）， with 15 guinea pigs in each group. The myopic refraction， axial length in each group and expression level of iNOS in the retina of guinea pigs were observed. Results Compared to group A， myopia increased and the axial length prolonged significantly， and the level of iNOS increased obviously in FDM-induced group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared to FDM-induced group， the level of iNOS significantly reduced （P < 0.05）， and the degree of myopia and the axial length were severely inhibited in guinea pigs treated with FDM plus NOS inhibitor injected. Conclusion The expression of iNOS in retina in FDM guinea pigs increases， while NOS inhibitor can effectively inhibite the occurrence of myopia. The synthesis of nitric oxide promotes FDM in guinea pig.

[Key words] Form-deprivation myopia； iNOS； NOS inhibitor； Guinea pigs

近視是最常见的视力障碍，是世界上视力障碍的主要原因[1]。其发病机制一直是眼科研究的重要课题，但是其发病的确切机制仍待进一步阐明。

通过形式剥夺或眼镜镜片操纵，能够改变眼睛生长和屈光不正[2]。近视剥离（formation of deprivation，FD）首先在猴子模型中实现，通过缝合眼睑形成[3]。在许多动物研究中，FD也可以通过在眼睛上佩戴的半透明漫射镜或扩散镜片。通常，眼睛戴上扩散镜片可以轴向过度伸长，诱导近视的形成（通过穿戴扩散镜片引起的近视与人眼疾病如角膜炎或角膜混浊引起的近视相似，因此将此用作近视模型，以了解那些因素导致轴向近视。

其中，形觉剥夺性（form-deprivation myopia，FDM）是目前常用的一种建立动物近视模型的手段，通过用缝合眼睑或戴弥散镜片或半透明眼罩来严重破坏动物的形体视觉所引起的近视[4]。目前的研究表明，FDM能够影响视网膜上多种神经递质与生长因子水平[5]。一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种小分子内源性反应气体，近期的研究发现NO可以作为视网膜的神经递质或调质，不仅参与视觉生理，还参与了FDM的形成过程[6]，强烈或间歇（闪烁）照明增加了其合成和释放[7]。当应用于视网膜时，NO供体模拟能够增加照明的适应效应[8]，而一氧化氮合成酶（nitric oxide synthetase， NOS）催化L-精氨酸合成NO，其抑制剂模拟照明减少的功能效应[9]。因此本文检测了NOS在FDM中发挥的重要作用，以进一步证明NO在FDM豚鼠模型中的调控作用。endprint

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择出生15 d 清洁级豚鼠，雄性（180 g左右）由上海斯莱克实验动物实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK（沪）0014。将豚鼠置于干净的环境中，自由获取食物和水，适应1周后用于本研究。所有程序均按照浙江大学实验动物管理委员会的指导方针进行。

1.2 建立FDM模型以及玻璃体注射

将豚鼠随机分为7组，每组各15只。A组：无FDM处理；B组：FDM诱导10 d；C组：FDM诱导20 d；D组：FDM诱导10 d+NOS抑制剂注射；E组：FDM诱导20 d+NOS抑制剂注射；F组：FDM诱导10 d+褪黑素注射；G组：FDM诱导20 d+褪黑素注射。依据参考文献[10]建立豚鼠FDM模型。豚鼠的头部被乳胶球覆盖，留下左眼、鼻子、嘴巴和耳朵暴露在空气中。每天用微量注射器向其玻璃体内注射预定药物，注射体积均为10 μL。NOS抑制剂NG-（1-Iminoethyl）-L-ornithine（L-NIO）和L-NG-monomethyl arginine（L-NMMA）使用浓度为0.3 m mol/L，褪黑素使用剂量为2 mg/kg。

1.3 眼屈光和轴向长度测量

分别在实验前、实验后1周和2周进行眼屈光测量。在测量前1 h时，将0.25%托品酰胺滴入眼睛以麻痹睫状肌。视网膜检查由验光师在黑暗的房间中以双盲方式进行。用1%氟烷氧轻度麻醉动物，通过A扫描超声（AVISO Echograph class I-Type Bat；Quantel Medical，France）测量轴向长度。

1.4 蛋白质印迹（Western bolt）分析

用pH 7.0含有10 mmol/L磷酸钠，0.15 mol/L NaCl，1%NP-40，1 mmol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF和蛋白酶抑制剂的冷裂解缓冲液裂解视网膜组织中。12 000×g离心15 min。收集上清液，使用MicroBCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。12.5%变性SDS-PAGE分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。将iNOS抗体与PVDF膜进行温育，随后用HRP标记的IgG孵育，进行显色。使用图像软件ImageJ对Western blot进行定量分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用Pearson相关性分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组屈光度的比较

A、B、C、D、E、F、G组屈光度依次为（1.72±0.20）、（-2.68±0.42）、（-5.68±0.51）、（-1.38±0.44）、（-3.44±0.64）、（-1.32±0.32）、（-3.09±0.64）D，差异有统计学意义（P < 0.05）。与A组比较，B组、C组屈光度明显下降，且C组屈光度低于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。与B组比较，D组、F组屈光度有所提高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与C组比较，E组、G组屈光度有所提高，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 各组眼轴比较

A、B、C、D、E、F、G组眼轴依次为6.97±0.13、7.50±0.19、8.21±0.31、7.17±0.20、7.68±0.22、7.12±0.31和7.59±0.24，差异有统计学意义（P < 0.05）。与A组比较，B组、C组眼轴增长，且C组眼轴长于B组，差异有统计学意义（P < 0.05）。与B组比较，D组、F组眼轴有所缩短，差异有统计学意义（P < 0.05）。与C组比较，E组、G组眼轴有所缩短，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 屈光度与FDM眼轴的相关性分析

FDM眼轴和屈光度呈负相关（r=-0.968，P < 0.01）。见图1。

2.4 检测视网膜组织中iNOS的表达量

随着FDM时间的延长，视网膜组织中iNOS水平上升，B组iNOS是A组的（1.58±0.02）倍，差异有統计学意义（P < 0.05）；C组达到（2.40±0.07）倍，差异有统计学意义（P < 0.05）。抑制剂处理可以有效抑制iNOS的上升，D组iNOS是A组的（1.25±0.04）倍，F组是A组的（1.16±0.07）倍；E组iNOS是A组的（1.39±0.08）倍，F组是A组的（1.69±0.05）倍。见图2。

3 讨论

本研究检测了一氧化氮合成酶是否参与调控豚鼠FDM模型，通过使用之前已经报道的两种NOS抑制剂的混合物，可以很好地阻断豚鼠NOS的合成，抑制FDM的发生。该研究中所使用的NOS抑制剂在之前很少被报道，因此，为之后NOS抑制剂的选择提供了有意义的参考。

首先，NO在眼中作为神经调节器和血管扩张剂发挥着重要作用，但它也调控着眼睛生长和平滑肌松弛，对于近视来说尤其关键[11]。NO在神经、心血管系统以及炎性反应中同样作为重要的信号分子。由于其不成对的电子，NO是一个自由的不带电的自由基。NO生产不足和过量生产都可导致各种眼睛疾病。所以用NO供体和抑制剂治疗或预防这些眼睛疾病，例如近视等，是近年来研究的热点[11]。首先，通过使用NO抑制剂或者确定几种NOS同工型的活性来尝试探究NO在近视的发生和发展中的作用。在两个最广泛使用的动物近视模型中：FDM和晶状体诱导近视（lens-induced myopia，LIM）玻璃体内注射N-ω-硝基-L-精氨酸甲基酯（L-NAME；NOS抑制剂）抑制近视发展。这表明NO调节视网膜途径，导致LIM和FDM。类似的研究表明，使用L-NAME不仅对于脉络膜，而且对巩膜蛋白多糖的合成也具有调节作用[12]。豚鼠模型NO激活可溶性鸟苷酸环化酶，从而增加cGMP水平。FDM组，视网膜NOS活性在FD后7 d低于对照组，然而在FDM 14和21 d后高于对照组。cGMP的浓度表现出与NOS活性相似的变化，这暗示着NOS活性非常可能通过cGMP介导[13]。endprint

NO是通過NOS合成的，目前已知有3种NOS，包括神经元型NOS（nNOS/NOS1），内皮型NOS（eNOS/NOS3） 以及诱导型（iNOS/NOS2）。其中nNOS和eNOS组成型表达，需要钙的激活，而iNOS受到转录调控，其活性不依赖钙[14]。iNOS仅在内毒素，炎症和某些细胞因子如白细胞介素-1（IL-1），IL-6，肿瘤坏死因子（TNF）等的病理状态下才能诱导。一旦诱导，iNOS会长时间产生大量的NO，使NO转化为NO2，亚硝酸盐，过氧亚硝酸盐和自由基，以诱导病理生理作用，如视神经变性，导致青光眼、视网膜病变、年龄相关性黄斑变性（AMD）、近视、白内障和葡萄膜炎。 为了治疗和预防这些眼睛疾病，可以尝试使用iNOS活性或 iNOS诱导的抑制剂[15]。褪黑素是由松果体和视网膜产生的， 当褪黑素与其受体作用之后能够调节房水的产生，调控眼压。眼压是近视程度重要的调节因素，当然近视还受到神经递质、环境以及基因等因素的共同作用。因此，褪黑素是目前已知的重要的调节近视的因子[16]。目前的研究表明，褪黑素能有效抑制NOS的活性，减轻NO引起的视网膜氧化损伤，从而抑制体内NO的过度产生及其活性氮分子的水平[17]。FDM最突出的变化是眼轴的延长和眼球增大。L-NMMA作为非特异性NOS抑制剂，是L-精氨酸类似物，L-NIO对eNOS的特异性比iNOS特异性高4倍[18]。L-NIO和L-NMMA对iNOS的抑制效果已经在其他研究中报道，包括人类骨关节炎[19]、血小板聚集[20]等方面。本文中联合使用L-NIO和L-NMMA作为NOS抑制剂，能够有效抑制iNOS的蛋白水平，同时抑制FDM的程度和眼轴的长度。

综上所述，检测屈光度和眼轴长度等指标表明，加入NOS抑制剂能够显著抑制豚鼠FDM近视程度，阐明了NO合成酶调控了豚鼠FDM的发生与发展。

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