猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELISA检测方法的建立

2017-09-21杨若松祁晓萌熊雅婷

食品安全导刊 2017年7期

杨若松+祁晓萌+熊雅婷

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS）又名“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种主要以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状及高死亡率为特征的高度接触性传染病[1]。PRRS于1987年在美国首次发现，1991年荷兰中央兽医研究所首次分离得到病毒，我国在1996年首次报道[2]。

在我国，猪群感染PRRSV后出现混合感染、继发感染的现象非常严重，这与PRRSV的感染机制有关。PRRSV感染机体后以机体免疫系统细胞为靶细胞，从而抑制免疫系统功能，导致其他病原极易乘虚而入。无论感染了传统PRRSV还是高致病性PRRSV，被感染的猪均会表现出猪呼吸障碍等多种症状，临床上多与副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、链球菌、支原体等有关。试验证明，高致病性PRRSV感染可以加剧副猪嗜血杆菌感染，引发严重的临床表现[3]。

由于PRRSV可在宿主体内的巨噬细胞中进行复制，导致无症状的持续感染。该病毒通过鼻黏膜和上呼吸道上皮细胞进入宿主体内，并在鼻黏膜、呼吸系统的巨噬细胞以及淋巴组织中进行原发性复制。随后通过血液循环到达继发性复制部位，如大脑、心、肺、胸腺、脾、肝、淋巴结、肾、肾上腺、小肠、睾丸等。病毒可进入易感妊娠母猪体内，跨越胎盘感染胎儿。

PRRS血清学诊断方法是应用最广泛的动物疫病诊断方法。关于PRRSV的血清学诊断，国内外己建立了多种检测PRRSV抗体的方法，主要有免疫过氧化物酶单层实验（immuno peroxidase monolayer assay，IPMA）[4]、间接免疫荧光检测方法（indirect immunoin fluscent assay，IFA）[5]、血清中和试验（Serum Neutralization，SN）[6]以及酶联免疫吸附测定试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。目前许多国家己把酶联免疫吸附试验作为PRRS日常监测和临床诊断的常规手段，因其抗原用量很少，检测过程依靠仪器自动化，故而适合大规模的快速检测。

核衣壳蛋白N作为PRRSV主要的结构蛋白，具有很强的免疫原性，是该病毒ELISA诊断方法中应用最多的靶抗原[7]。间接ELISA方法是利用酶标记的二抗（辣根过氧化物酶HRP标兔抗猪IgG）以检测与固相PRRSV抗原结合的PRRSV受检抗体，故称为间接法。间接法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断，此法与直接法类似，区别在于把没有酶标记的一级抗体改用酶标记过的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。其优点在于利用二抗可以加强信号，只需通过变换包被的抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相对应抗体的方法，完成不同的测定分析[8]。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

1 材料与方法

1.1 材料

重组PRRSV-N蛋白、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗猪IgG、176份猪血清。

1.2 方法

包括对蛋白质包被浓度、包被缓冲液、封闭液、封闭条件、稀释倍数、作用时间及温度、以及最佳显色时间及温度等指标的确定。

2 方法验证

2.1 特异性试验

用建立的PRRSV-N ELISA检测方法分别检测猪瘟阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、猪乙型脑炎病毒阳性血清、猪细小病毒阳性血清。计算S/P值，并对结果进行分析。

2.2 重复性试验

用同批次抗原包被酶标板检测同一份血清抗体来检测板间与板内变异及批间差异，计算同一份检测样本阳性百分率的变异系数（C.V.=S/X×100%，S：标准差，X：算术平均值），以检验板内和板间检测样品的重复性。

2.3 与商品化试剂盒的对比

用本试验建立的PRRSV-N抗体ELISA检测方法对美国IDEXX公司PRRSV抗体间接ELISA试剂盒检测过的179份血清进行检测。