建立一种快速鉴定大西洋鳕鱼 及其制品的SYBR Green荧光PCR方法

孙晓飞，蒋 丹，万 超，刘淑艳，吴 斌

(辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001)

建立一种快速鉴定大西洋鳕鱼 及其制品的SYBR Green荧光PCR方法

孙晓飞，蒋 丹，万 超，刘淑艳，吴 斌

(辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001)

通过大西洋鳕鱼CoxI序列的比对分析，在序列的差异处设计了大西洋鳕鱼的特异性引物，建立了一种大西洋鳕鱼SYBR Green荧光PCR定性检测方法，并进行了引物特异性和灵敏度分析.结果表明：检测的大西洋鳕鱼样品和49份其他动、植物样品DNA中，只有大西洋鳕鱼样本出现显著扩增，6次平行反应的Ct值为23.216±0.113，5份大西洋鳕鱼同属鳕鱼样品和44种常见其他动、植样品均无明显扩增曲线.模拟样品灵敏度检测实验显示，该特异性引物可用于检测质量分数为0.01%的大西洋鳕鱼肉粉，灵敏度可达0.06 ng/μL.通过对市售鳕鱼片检测的验证，该方法特异性强，灵敏度高，可用于食品中大西洋鳕鱼成分真实性的鉴别.

大西洋鳕鱼成分；SYBR Green荧光PCR； CoxⅠ

大西洋鳕鱼(Gadusmorhua)为鳕形目鳕科鳕属鱼类，原产于北欧至加拿大及美国东部的北大西洋寒冷水域，是全世界年捕捞量最大的鱼类之一.鳕鱼肉味甘美、营养丰富，经济价值极高，[1]其主要出口国是加拿大、冰岛、挪威及俄罗斯.在我国鳕鱼的消费量呈逐年递增趋势.鳕形目鱼类品种繁多，由于形态学差异较小，仅用传统方法例如鳍条数、鳃耙数和脊椎骨数难以准确地区分出鳕鱼品种.而不同的鳕鱼品种市场价格差异悬殊，大西洋鳕鱼常被其他鱼类以次充好，曾经有不法商贩用 “油鱼”冒充大西洋鳕鱼导致食用者发生腹泻的报道；此外，大西洋鳕鱼又常被加工成鱼肝油、冷冻切片等制品，鉴别更加困难.[2]因此，急需一种灵敏、特异的鉴定大西洋鳕鱼及其相关制品的方法[3-4].本文采用实时SYBR Green荧光PCR技术对大西洋鳕鱼成分进行了定性检测，在PCR反应体系中加入SYBR Green荧光染料，荧光染料掺入DNA双链后发射荧光信号，利用荧光信号的积累而实时监测整个PCR扩增进程，进行定性及定量分析，进而检测大西洋鳕鱼成分.该方法具有简便、快速、准确的特点，在物种鉴定领域有着广泛的应用前景[5-12].

1 材料与方法

1.1 材料

试剂盒及试剂：海洋动物基因组DNA提取试剂盒(天根化科技有限公司)；植物基因组DNA提取试剂盒(DP305，天根生物)；Premix Ex Taq(TaKaRa公司)；琼脂糖(北京沃比森科技有限公司).引物由上海生工生物公司合成.

检测样品：大西洋鳕、绿青鳕、太平洋鳕、北太平洋无须鳕、黑线鳕、南蓝鳕、黑鳕、细鳞壮鳕、阿拉斯加鳕鱼、欧鳇、史氏鲟、俄罗斯鲟、小体鲟、西伯利亚鲟、达氏鲟等鱼类样品采集于北京市水产科学研究所鲟鱼繁育基地；拟庸鲽、大菱鲆、牙鲆、多宝鱼、黄盖鲽、舌头鱼、太平洋鲱、大西洋鲑、大马哈鱼、红鱼、大泷六线鱼、大黄鱼、中国花鲈、大西洋蓝枪鱼、银枪鱼、蓝鳍金枪鱼、条纹四鳍旗鱼、蓝鳍红娘鱼、黑点褐胸鳝、日本鳗、双髻鲨、高鳍真鲨、鲫鱼、草鱼、鲤鱼、鳙鱼等鱼类及其制品、大西洋鳕鱼制品均购于大连市水产市场和超市.

其他样品：鸡、鸭、鹅、猪、牛、大豆、绿豆、玉米、小麦均购于超市.

1.2 仪器与设备

PCR仪(7500 Fast，美国ABI公司)；凝胶成像系统(GelDoc，美国Bio-Rad公司)；超微量分光光度计(Nanodrop 2000，美国ThermoFisher公司).

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒，提取100 mg鱼、肉类样品的总DNA；使用植物基因组DNA提取试剂盒，提取100 mg植物类样品的总DNA.

1.3.2 实时荧光PCR引物设计 通过GadusmorhuaCoxI序列的比对分析，在序列的差异处设计大西洋鳕鱼特异性引物(见图1).上游引物序列为：5′-AATCTTAATACTTCTTTCTTTGAC-3′；下游引物序列为：5′-CTCAGACTATACCCATATACC-3′.

方框内示引物结合位点

1.3.3 引物特异性检测 利用上述引物对大西洋鳕鱼及其他样品DNA进行实时荧光PCR扩增.荧光PCR反应体系为20 μL，包含SYBR Premix反应液10 μL、模板DNA 1 μL、引物各1 μL、灭菌双蒸水7 μL.反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，40个循环.

1.3.4 灵敏度检测 将大西洋鳕鱼DNA梯度稀释，制备成30，6，1.5，0.3，0.06，0.015 ng/μL 6个浓度梯度样品，进行DNA浓度灵敏度实验；将鲫鱼肉粉与大西洋鳕肉粉混合配制成含大西洋鳕成分10%，1%，0.1%，0.01%，0.001%的质量分数梯度混合样品，进行模拟样品灵敏度实验.

1.3.5 市售大西洋鳕鱼制品的检测 市售大西洋鳕鱼制品主要为冷冻切片，购置大西洋鳕鱼鱼冻切片30份，大西洋鳕鱼肝油5份，太平洋鳕鱼冷冻切片15份，利用所建立的荧光PCR检测方法测定其大西洋鳕鱼成分.

2 结果与分析

2.1 DNA质量分析

利用超微量分光光度计测定样品DNAD(260)值、D(280)值.所有提取的DNAD(260)/D(280)值均为1.8～2.0，表明所有抽提的DNA适用于PCR 检测.

2.2 引物的特异性

提取大西洋鳕鱼样品和49份其他动植物样品DNA，以100 ng DNA作为模板进行6次重复实验，只有大西洋鳕鱼样本出现显著扩增，6次平行反应的Ct(cycle threshold)值为23.216±0.113，5份大西洋鳕鱼同属鳕鱼样品和44种常见其他动植样品均无明显扩增曲线 (见图2).

a 扩增曲线，b 熔解曲线.1大西洋鳕鱼，2 阿拉斯加鳕鱼，3 北太平洋无须鳕，4 绿青鳕，5 黑线鳕，

①7.5 ng/μL扩增结果；②1.5 ng/μL扩增结果；③0.3 ng/μL扩增结果；④0.06 ng/μL扩增结果；⑤0.012 ng/μL扩增结果；⑥空白对照

图3大西洋鳕鱼DNA浓度灵敏度检测

2.3 灵敏度检测

①10%扩增结果；②1%扩增结果；③0.1%扩增结果； ④0.01%扩增结果；⑤0.001%扩增结果；⑥空白对照 图4 大西洋鳕鱼模拟样品灵敏度检测

使用5倍梯度稀释的大西洋鳕鱼总DNA作为模板，进行荧光PCR检测，当DNA质量浓度≥0.06 ng/μL时均可特异扩增(见图3).由图3可见，大西洋鳕鱼基因组DNA检测灵敏度可达0.06 ng/μL.将鲫鱼肉粉与大西洋鳕鱼肉粉配制成质量分数梯度混合样品进行荧光PCR扩增，结果(见图 4)显示质量分数0.01%～10%的样品均可出现稳定的扩增曲线，0.001%预混样品未出现稳定的扩增曲线，表明模拟样品灵敏度检测可检测出质量分数为0.01%的大西洋鳕鱼肉粉.

2.4 市售大西洋鳕鱼制品检测结果

市售大西洋鳕鱼制品冷冻切片检测结果见表1.其中大西洋鳕鱼切片均出现阳性结果，太平洋鳕鱼切片均为阴性结果；精加工的大西洋鳕鱼肝油未能出现特异性扩增曲线.

表1 市售大西洋鳕鱼制品的源性检测

3 讨论

作为对掺假或以次充好进行监管的有效手段，荧光PCR检测技术日益成熟，而国内目前尚未有使用荧光PCR技术对大西洋鳕鱼成分进行定性检测的报道，本研究属国内首次.SYBR Green是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料；SYBR Green荧光PCR检测方法相对于探针法需要额外添加引物，可以克服普通PCR法灵敏度不高等缺点，兼有简单方便、灵敏度高、特异性好等优点.本研究所建立的大西洋鳕鱼成分SYBR Green荧光PCR检测方法具有良好的特异性；大西洋鳕鱼基因组DNA检测灵敏度可达0.06 ng/μL，模拟样品灵敏度检测可达质量分数仅为0.01%的大西洋鳕鱼肉粉，可满足日常检测的要求.市售实际样品的检测结果表明，该方法具有很强的实用性.对于大西洋鳕鱼肝油而言，由于在生产过程中需要经过一系列的复杂精细加工，DNA受到很大程度的破坏，所以该法不能用于鳕鱼肝油中大西洋鳕鱼成分的鉴定.但对于冷冻肉切片等未经深加工的样品来说，可以准确地鉴定出大西洋鳕鱼成分.

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(责任编辑：方林)

AnewSYBRGreenfluorescentPCRmethodforrapididentificationofGadusmorhuaanditsproducts

SUN Xiao-fei，JIANG Dan，WAN Chao，LIU Shu-yan，WU Bin

(Liaoning Entry-Exit Inspection and Qurantine Bureau，Dalian 116001，China)

Through Atlantic cod(Gadusmorhua) CoxI sequence comparison analysis，designed the Atlantic cod specific primers，establish the Atlantic cod SYBR Green fluorescence PCR qualitative detection method containing of specificity and sensitivity of detection assays.The results showed that only the Atlantic cod sample was significant amplification among 50 kinds of animal and plant sample.Six parallel reaction of Ct value was 23.216±0.113，5 samples of the Atlantic cod belong to cod and 44 kinds of common other move plant samples is negtive.Simulated sample sensitivity experiments showed that the primers could be detected 0.01% huso compent，the limit of detection was 0.06 ng per reaction.The further quantitative assay revealed that the method has high accuracy and sensitivity，and is able to detect Atlantic cod gradients.

Gadusmorhua；SYBR Green real-time fluorescence PCR；CoxⅠ

1000-1832(2017)03-0127-04

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.03.026

2016-08-16

国家质检总局质检公益性行业科研项目(201410059).

孙晓飞(1983—)，女，硕士，兽医师；通讯作者：蒋丹(1978—)，女，博士，高级工程师，主要从事物种鉴定研究.

S 937 [学科代码] 240·50

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