基于ITS2序列的维吾尔药材神香草鉴定研究△

杨珺，樊丛照，李晓瑾*

(1.昌吉职业技术学院药学院，新疆 昌吉 831100；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所 国家中医药管理局新疆中药民族药资源重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830002)

·基础研究·

基于ITS2序列的维吾尔药材神香草鉴定研究△

杨珺1，樊丛照2，李晓瑾2*

(1.昌吉职业技术学院药学院，新疆 昌吉 831100；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所 国家中医药管理局新疆中药民族药资源重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830002)

目的：采用DNA条形码技术建立维吾尔药材神香草鉴别的方法。方法：使用DNA条形码ITS2序列，建立了维吾尔药材神香草基原植物DNA条形码ITS2序列标准数据库，对市售11份“神香草”药材进行鉴定。结果：市售神香草药材仅有2份为维吾尔药材标准中收录的硬尖神香草，1份为神香草属植物，1份为鼠尾草属植物，其余7份来源于荆芥属植物。结论：DNA条形码ITS2序列可作为鉴定维吾尔药材神香草及其伪品药材的有效工具。

神香草；ITS2；鉴定；DNA条形码

维吾尔常用药材神香草，维吾尔语名“祖帕”，维吾尔药材标准中记载其基原植物为唇形科(Lamiaceae)多年生草本植物硬尖神香草H.cuspidatus，其全草均可入药，维医广泛用其治疗气管炎的咳嗽、气喘、感冒发烧和风湿等病证[1-4]。目前硬尖神香草多为野生，由于资源短缺，使市场供应不足而出现混淆品，主要为大苞荆芥Nepetabracteata[5]。大苞荆芥维吾尔语名亦为“祖帕”，易与硬尖神香草混淆，但其化学成分，药性及作用功效与硬尖神香草存在显著差异[6-7]，误用会危害患者的生命健康。针对市场上出现的混淆品，已有研究者采用性状、显微及理化鉴别等方法对硬尖神香草与大苞荆芥进行了鉴定[5]，虽然为维吾尔药材神香草的质量控制提供了一定的依据，但这些鉴定方法需要很强的专业性，不适于推广应用。

相比之下，DNA条形码技术[8]能够实现快速、准确和自动化的物种鉴定，适用于非专业工作者。2011年，中国植物条形码工作组(Chinese Plant BOL Group)建议将ITS/ITS2序列作为种子植物的核心DNA条形码[9]。ITS2序列作为药材鉴别的DNA条形码，已被载入《中华人民共和国药典》2010版第三增补本[10]和2015版[11]，在常用中药民族药材红景天[12]、枸杞[13]、蜀葵[14]等药材真伪鉴别中得到验证。

1 材料与方法

1.1实验材料

此研究中所使用的16份神香草属植物样本采自新疆不同地区，包括11份硬尖神香草及5份大花神香草，由新疆中药民族药研究所副研究员王果平鉴定，凭证标本保存于新疆中药民族药研究所标本馆(新疆XTNM)；自市场收集11份“神香草”药材样品。神香草基原植物样本ITS2单倍型序列已提交至GenBank(表1)。

表1 实验材料信息

1.2试剂

PCR扩增所用引物由生工生物工程合成，ITS2正向序列：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；DNA提取试剂盒(DP305-03)、DNA聚合酶及dNTP等均购自天根生物(TIANGEN)。

1.3实验仪器

实验所使用的DNA提取研磨仪为GRINDER，型号GT-100；离心机为上海安亭科学仪器，型号AnkerTGL-16C；PCR扩增仪为AnAnalytikJenacompany，型号070-851。

1.4方法

1.4.1DNA提取及检测 称取干燥药材(枝叶)30mg，DNA提取研磨仪1000r·min-1研磨2min，植物DNA提取试剂盒提取总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。

1.4.2PCR扩增及测序 反应体积25μL，dNTP0.4μL(10mmol·L-1)，PCR缓冲液2.5μL(10×)，引物各1.0μL(2.5μmol·L-1)，聚合酶1.0U，总DNA1μL(约30ng)。引物ITS2扩增程序：94℃，变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s(40个循环)；72℃延伸10min[15]。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测并纯化后，使用ABI3730XL(AppliedBiosystemsCo.，USA)测序仪由美吉生物测序公司进行双向测序。

1.5数据处理

测序峰图用CodonCodeAlignerV4.0.4(CodonCodeCo.，USA)校对拼接，去除引物区。将所有序列由软件MEGA5.0(molecularevolutionarygeneticsanalysis)分析比对[16]，ITS2序列基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法，去除两端5.8S和28S区段获得ITS2间隔区序列[17]，用邻接(NJ)构建系统聚类树，使用bootstrap(1000次重复)检验各分支的支持率[18]。

1.6BLAST鉴定

将测序获得的药材样本序列在GenBank数据库(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)进行BLAST鉴定，搜索相似性最高的植物序列。

2 结果

2.1序列信息分析

ITS2序列分析结果显示，硬尖神香草为2个单倍型，长度均为219bp，GC含量变化为68.0%～68.5%；大花神香草单倍型数为2，长度为219bp，GC含量为68.0%；11个药材样本有7个单倍型，其中编号为YC130006、YC130008、YC130011为同一单倍型，编号YC130007与YC130010序列一致，YC130005与YC130009一致。

表2 ITS2序列信息

2.2种内及种间变异位点分析

16份植物样本中，硬尖神香草种内存在1个变异位点，为187bp位点的A-C变异，大花神香草种内有2个变异位点，分别为164bp位点的C-T变异及187bp位点的A-C变异，硬尖神香草与大花神香草种间差异不显著。在7个单倍型的神香草药材序列中，编号为YC130001的药材与硬尖神香草相似，编号为YC130009的药材序列与硬尖神香草一致，其余序列均与硬尖神香草之间变异较大。

2.3ITS2序列BLAST鉴定结果

11条药材序列GenBank数据库BLAST结果如表3所示，仅编号为YC130001、YC130005及YC130009的药材与神香草属植物序列相似度较高，其中标号为YC130005及YC130009的药材与硬尖神香草一致，判定为正品药材，编号为YC130001的药材来源于神香草属其他植物。编号为YC130004的药材来源于鼠尾草属植物，其余7份药材均来源于荆芥属植物。

2.4神香草属植物及药材NJ树鉴定结果

基于硬尖神香草、大花神香草及药材单倍型序列构建NJ鉴别树，结果如图2所示，仅编号为YC130001及YC130009的药材与硬尖神香草及同属植物聚在一起，支持率为99%；编号为YC130002、YC130003、YC130006及YC130007的药材聚为一支；YC130004的药材单独为一支。

图1 不同单倍型实验样本种内及种间变异位点比较

药材编号相似度最高植物拉丁名相似度最高植物GenBank登录号中文名相似度(%)YC130001H.cuspidatusKF454217神香草属植物95YC130002NepetabinaloudensisAJ515311荆芥属的一种92YC130003NepetaassurgensAJ515316荆芥属的一种93YC130004SalviadaghestanicaKU563878鼠尾草属的一种89YC130005H.cuspidatusKF454217硬尖神香草100YC130006NepetaassurgensAJ515316荆芥属的一种94YC130007NepetaassurgensAJ515316荆芥属的一种93YC130008NepetaassurgensAJ515316荆芥属的一种94YC130009H.cuspidatusKF454217硬尖神香草100YC130010NepetaassurgensAJ515316荆芥属的一种94YC130011NepetaassurgensAJ515316荆芥属的一种94

图2 基于ITS2序列的单倍型NJ鉴别树，在图中显示分支支持率(≥50%，bootstrap 1000次重复)

3 讨论

本研究首次采用DNA条形码技术对市售维吾尔药材“神香草”进行鉴定，与以往的鉴定方法相比，DNA条形码鉴定不需要样本性状完整，仅需要微量的入药部位即可。研究结果表明，从维吾尔药材“神香草”药用部位枝叶中可成功提取基因组DNA，其DNA质量可满足DNA条形码鉴定的需求。

本研究以多途径来源的硬尖神香草及大花神香草植物ITS2序列建立了鉴定数据库，将市售药材中获得的ITS2序列与鉴定数据库比对，虽然NJ树鉴定结果显示，编号为YC130001及YC130009的药材均与硬尖神香草基原植物聚在一起，但NJ树并不能完全鉴定植物种，进一步BLAST鉴定结果表明，编号为YC130009的药材来源于硬尖神香草，编号为YC130001的药材来源于神香草属其他植物；大花神香草由于其资源分布有限，作为药材的可能性较小。

在GenBank中经过BLAST对比，11份药材样品中有7份与荆芥属植物相似度较高，因此推测此7份药材可能为报道的大苞荆芥，大苞荆芥维吾尔语名为祖帕，与神香草维语同名，使得神香草药材来源混乱，市场伪品及混淆品数量多。此外，编号为YC130004的药材经比对与鼠尾草属植物，可由此判断市场上存在使用鼠尾草属植物充当神香草的现象。

DNA条形码在已经在植物分类及草药鉴定等诸多领域广泛的应用[19-22]，本文将DNA条形码应用到维吾尔药材鉴定领域，应用此技术成功鉴定出市售药材神香草的真伪，随着研究的深入，相信DNA条形码技术会不断应用于其他维吾尔药材鉴定领域，为维吾尔药材的真伪鉴别提供一个可靠的技术手段，以保障药材的正确性，保护使用者的利益，同时有利于药材监管部门对进出口维吾尔药材进行监测。

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StudyonOriginPlantofUygurMedicineHyssopuscuspidatusBasedonITS2Sequence

YANG Jun1，FAN Congzhao2，LI Xiaojin2*

(1.ChangjivocationalandtechnicalcollegeofPharmacy，Changji，831100China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthnicalMateria，StateAdministrationoftraditionalChinesemedicineKeyLaboratoryoftraditionalChinesemedicineandethnicmedicineresources，Urumqi830002，China)

Objective：To establish a method for identification of identify the origin plant of Uygur medicineHyssopuscuspidatusby DNA barcode technology.Methods：DNA barcode ITS2 sequence was used to establish a standard database ofH.cuspidatus，and eleven medicinal materials “H.cuspidatus” were authenticated by the identification system.Results：Only two medicinal materials were fromH.cuspidatus，one of them was fromHyssopusgenus，and one was fromSalviagenus，the other 7 samples were fromNepetagenus.Conclusion：ITS2 sequence can be used as an effective barcode to identify Uygur MedicineH.cuspidatusfrom its adulterants.

Hyssopuscuspidatus；ITS2；identification；DNA barcode

新疆维吾尔自治区科技厅高新技术研究发展项目(201517107)

] 李晓瑾，研究员，研究方向：中药资源；Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.006

2017-02-28)

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